[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 sale 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
cytiva
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
시스템 점검 : 12월 3일 오후 10시
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
조회 131  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 overlap pcr 하고 gel extraction하여 phusion polymerase 이용해서 증폭하였는데 문제가 있습니다
알asdfdsa321(대학원생)  | 10.29 10:10

앞뒤 500 bp짜리를 Q5 polymerase를 이용하여 overlap pcr 진행하였습니다.

이후 gel extraction을 통해 1000 bp 짜리만 얻어서, 이를 template로 사용하여 phusion polymerase를 이용하여 1000(500+500)의 앞뒤 프라이머를 이용하여 pcr을 진행하였습니다.

원래대로라면 1000 bp짜리 band가 두껍게 나와야하는데, 젤 내린 결과 500도 아니고 600 정도의 밴드가 가장 두껍고 1000짜리 밴드는 희미하게 보이는 것을 볼 수 있었습니다.

이 때 어떤 점이 문제일지 궁금하고, 해결 방법에는 어떤 것이 있을까요?

사용한 프라이머와 1000 bp 짜리를 align 해 봤을 때 겹치는 sequence가 많지는 않았습니다..ㅠㅠ

#pcr
 
#primer
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.29 10:26  

overlap PCR에 뭔가 착오가 있는 것 같습니다.

- overlap PCR이 진행되면 1Kb 증폭이 되기 때문에 gel elution해서

2차 증폭을 할 필요가 없습니다.

- 몇 단계로 PCR했나요?

알asdfdsa321  |  10.29 15:27  

cas9을 이용하여 2000 bp짜리 gene을 deletion 하려고 생각하고 실험중입니다.

deletion 양 옆 500 bp를 arm으로 하여서 각각을 증폭해서 500, 500 fragment를 얻었고, 이 때 프라이머가 각각의 가닥에 겹치는 부분이 20~30 bp정도 있게 짠 것을 사용하였습니다.

이 두 fragment를 프라이머 없이 Q5로 오버랩 pcr을 하였고, pcr purification을 한 것을 모아서 1 kb짜리만 gel extraction을 하였습니다.

위에서 얻은 1 kb짜리를 template으로 이용하여 phusion polymerase를 사용하여 젤을 내려서 확인해 보았더니 500 bp짜리만 많고 1 kb짜리가 많지 않은 상황입니다

대왕개구리SPEED  |  10.29 15:32  

- 이 두 fragment를 프라이머 없이 Q5로 오버랩 pcr을 하였고

: 이 단계에서1kb product가 많이 생겼을 겁니다.

1kb를 양 말단 primer로 다시 PCR하면 500bp는 안생길건데 이상하네요.

말단이 overlap된 500bp 2개를 정상적으로 PCR하면 상당히 많은 양의

1kb가 생기기 때문에 1kb를 elution하여 PCR하지 말고 사용하세요. 

꽃개구리느림보  |  10.31 11:25  
제가 경험한 Overlap PCR 실패는 대개 농도가 진한 원인이었습니다. overlap extension 시킨 것을 2차 end-to-end PCR할 때 1/10정도로 희석하고 PCR 반응액에 1, 2, 5 ul정도로 다르게 한 것을 한번에 돌리면. 그 중 어느 것에서는 예쁜 밴드가 나옵니다. 짧은 단편이 많이 나온다면 overlap extension이 잘 안되었거나 저처럼 2차 PCR에서의 농도 문제를 짚어 봐야겠죠.
답변하기
할인행사 광고 검색광고
인성크로마텍 인성크로마텍
세계에서 가장 빠르고 간편한 16S NGS Library Prep 키트 (데이터 분석 리포트 포함) (12.26까지)
비투바이오 비투바이오
B2BLACK FRIDAY: Sorenson, VOLO 등 실험실 소모품 2020년 마지막 할인! (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
Lucigen Competent cell 20% 할인행사 / nanostring DSP CTA / Fluor.. (12.8까지)
바이오닉스 바이오닉스
2020년 바이오닉스는 TECAN의 공식 파트너로 런칭! (런칭 프로모션 진행중) (1.24까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 하반기 프로모션 행사 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (12.31까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
sale
1/6  좌우
388,500116,600
47,20044,900
555,000
379,000
230,000
309,000
201,30060,400
158,40047,600
50,00015,000
22,7006,900
238,70071,700
793,400753,800
143,800136,700
242,400230,300
136,000
80,40024,200
739,000702,100
924,000
245,20073,600
79,50075,600
136,000129,200
887,200266,200
246,60074,000
139,000132,100
최근등록   더보기 >
필름밀착법(JIs z 2801)   11.30
카페인 추출 실험   11.30
Mammalian cell subculture에서의 PBS washing   11.29
cloning   11.29
렘데시비르 - rdrp 특정 결합부위 분자구조   11.29
백혈병 치료제 실험 관련 질문드립니다.   11.29
PCR로 DNA 복제하는 거랑 리가제효소, 제한효소를 이용해서 DNA복제하는 거의 차이가...   11.29
염석 관련 질문입니다.   11.28
enzyme unit 측정중 궁금증이 있습니다.   11.28
imagej 사용법, 디스크확산법 결과 분석   11.28
제품평가
[바이오탭스]
Mini Magnet Virtical Electrophoresis System
바이오탭스
모집인원: 15명
모집기간: ~12/9까지
신청조건: BRIC 회원
평가자 혜택

- 참가자 전원 2만원 상품권 제공
- 평가후 평가제품 구매 시 알루미나 플레이트와 콤 5개 제공
- 우수평가자 3명에게 5만원 상품권 추가 제공

제품평가자 모집중
최근답변자 우수답변자
알myj214

대왕개구리SPEED

알가가나

알systemic

개구리동물연구

꽃개구리느림보

개구리bio

앞다리scientic

대왕개구리강시

꽃개구리TX

개구리별숲

개구리식스센스

개구리bio

개구리남녀칠세마동석

개구리유전학도^^v

개구리곰돌2

실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
이제욱 연재중생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고