실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
SDS-PAGE 시 sample이 제대로 loading 되지 않는 것 같습니다
레벨2 빈님 (대학원생)
저번에 sample buffer 문제 일거 같다고 질문을 올렸었습니다.
buffer의 조성 자체가 잘못 되었다는 조언이 있어,
아예 제품을 이용해서 western을 진행하였는데,
여전히 동일한 증상이 반복되었습니다.
9월 이후에 진행한 western blot 결과가 전부 이런식으로 나와 추적을 해보니
sample buffer뿐 아니라, RIPA buffer도 새로 준비한 시점이었습니다.
sample buffer는 제품을 써도 동일한 증상이라 제외하고, RIPA buffer로 첨부한
파일에 쓴 조성으로 새로 준비하여 western을 진행하였습니다.
1번, 2번, 3번이 새로운 RIPA buffer로 준비한 결과들이며, band 자체도 번지고
특히 상단 부분에 항상 non-specific으로 보이는 것들이 보여집니다.
4번 (9월에 만듦), 5번은 예전이 만들어 놓은 positive sample인데,
4번은 3번과 같은 유전자를 확인한 것입니다.
어떤 문제인지 모르겠으나 같은 유전자임에도 band 선명도와 크기가 차이나는
것을 볼 수 있습니다.
sample은 RIPA buffer에 protein inhibitor cocktail 1X를 첨가하여 사용하고,
ice에서 20min간 반응을 합니다 (5분 마다 vortexing 진행)
이 후, 15,000rpm, 4도, 20min으로 centrifuge후 상층액만 옮겨, 5x sample buffer를
넣어 준 뒤, 100도, 10min 간 boiling을 진행하고, ice에서 3min 식히고 -20도에
보관하거나 SDS-PAGE loading을 진행합니다.
sample은 loading전에 vortexing후 spin down한 뒤, 상층액을 따서 사용합니다
새로 준비한 sample마다 저런식으로 결과가 나오고, 주변에 western을 진행하는
사람도 없어, 나름 대로 혼자서 해결해 보려고 하는데 뭐가 문제인지
해결이 잘 되지 않습니다
혹시 제가 진행한 부분에서 놓친 부분이나 실수한 부분이 있는지 궁금합니다.
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