[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 sale 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
cytiva
배너광고안내
이전
다음
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
겨울철의 실험실 안전 점검
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 237  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 SDS-PAGE 시 sample이 제대로 loading 되지 않는 것 같습니다
올챙이빈님(대학원생)  | 10.28 18:35
첨부파일 파일첨부: western error-2.pptx (66 KB)

저번에 sample buffer 문제 일거 같다고 질문을 올렸었습니다.

buffer의 조성 자체가 잘못 되었다는 조언이 있어,

 

아예 제품을 이용해서 western을 진행하였는데,

여전히 동일한 증상이 반복되었습니다.

9월 이후에 진행한 western blot 결과가 전부 이런식으로 나와 추적을 해보니

sample buffer뿐 아니라, RIPA buffer도 새로 준비한 시점이었습니다.

 

sample buffer는 제품을 써도 동일한 증상이라 제외하고, RIPA buffer로 첨부한

파일에 쓴 조성으로 새로 준비하여 western을 진행하였습니다.

 

1번, 2번, 3번이 새로운 RIPA buffer로 준비한 결과들이며, band 자체도 번지고

특히 상단 부분에 항상 non-specific으로 보이는 것들이 보여집니다.

4번 (9월에 만듦), 5번은 예전이 만들어 놓은 positive sample인데,

4번은 3번과 같은 유전자를 확인한 것입니다.

어떤 문제인지 모르겠으나 같은 유전자임에도 band 선명도와 크기가 차이나는

것을 볼 수 있습니다.

 

sample은 RIPA buffer에 protein inhibitor cocktail 1X를 첨가하여 사용하고,

ice에서 20min간 반응을 합니다 (5분 마다 vortexing 진행)

이 후, 15,000rpm, 4도, 20min으로 centrifuge후 상층액만 옮겨, 5x sample buffer를

넣어 준 뒤, 100도, 10min 간 boiling을 진행하고, ice에서 3min 식히고 -20도에

보관하거나 SDS-PAGE loading을 진행합니다.

sample은 loading전에 vortexing후 spin down한 뒤, 상층액을 따서 사용합니다

 

새로 준비한 sample마다 저런식으로 결과가 나오고, 주변에 western을 진행하는

사람도 없어, 나름 대로 혼자서 해결해 보려고 하는데 뭐가 문제인지

해결이 잘 되지 않습니다

 

혹시 제가 진행한 부분에서 놓친 부분이나 실수한 부분이 있는지 궁금합니다.

 

 

#band
 
#SDS-PAGE
 
#smear
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.28 18:58  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

WBT band는 SDS-PAGE가 내려간 모양 그대로 나오기 때문에 transfer 후

band는 어떻게 나왔나요?

NaCl 농도를 조금 내리고 100도에서 10분간 boiling하지 않아도 되고 3분이면

충분합니다.

열처리를 오래하면 단백질에 좋은 점은 없습니다.

또한 sample buffer를 조금 더 넣고 전기영동 해보세요.

올챙이빈님  |  10.28 19:55  

SPEED님

transfer 후 ponceau로 확인할 시에는 전반적으로 레인이 길게 내려와

특정 위치가 진하게 band로 보는건 확인할 수 없었습니다.

 

아래는 sample buffer를 더 첨가하라는 말씀이신가요?

1, 2, 3 sample의 loading volume은 1.0mm에서 정량없이 20ul loading 한 것 입니다.

대왕개구리SPEED  |  10.28 20:35  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

폰슈로 보는 것은 특정 위치 band를 보는 것이 아니라 전체적인 전기영동 상태

및 transfer 상태를 보는 것입니다.

특정 위치 band가 있더라도 그 위치에 단백질이 1 종류만 있는 것도 아닙니다.

band가 퍼지는 것은 1차 적으로 시료에 salt가 많은 것을 나타내기 때문에

sample buffer를 1X 이상으로 사용해서 퍼지는 것을 개선할 수 있습니다.

아니면 반드시 RIPA를 사용하지 않아도 됩니다.

동물세포는 lysis가 잘되기 때문에 Tris buffer에 SDS만 넣어도 사용가능합니다.

빈님  |  10.29 17:24   

SPEED님

답변 감사드립니다.

여기서 제가 의아한 점은 4번, 5번 sample들도 위에 적힌 조성으로 만든

RIPA buffer였습니다.

NaCl의 농도가 높다고 하셨는데, loading시 sample이 well에서 끌리는 현상은

pH와 관련이 있다고 볼 수 있는 건가요?

답변하기
할인행사 광고 검색광고
인성크로마텍 인성크로마텍
세계에서 가장 빠르고 간편한 16S NGS Library Prep 키트 (데이터 분석 리포트 포함) (12.26까지)
비투바이오 비투바이오
B2BLACK FRIDAY: Sorenson, VOLO 등 실험실 소모품 2020년 마지막 할인! (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
Lucigen Competent cell 20% 할인행사 / 단백질도 BiOptic Qsep series /.. (12.8까지)
바이오닉스 바이오닉스
2020년 바이오닉스는 TECAN의 공식 파트너로 런칭! (런칭 프로모션 진행중) (1.24까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
Eppendorf 2020 하반기 프로모션 행사 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR장비,초저온냉동고,M.. (12.31까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
sale
5/6  좌우
136,000129,200
309,000
246,60074,000
555,000
924,000
143,800136,700
80,40024,200
201,30060,400
739,000702,100
242,400230,300
388,500116,600
22,7006,900
158,40047,600
793,400753,800
379,000
238,70071,700
230,000
50,00015,000
139,000132,100
79,50075,600
136,000
887,200266,200
245,20073,600
47,20044,900
최근등록   더보기 >
paraffin block을 이용하여 ihc해도 dendrite가 안보여요ㅠㅠ   12.04
bacteria CFU 잴 때 큐벳 말고 96well plate 써서 ELISA 로 측정해...   12.04
TSB 배지 만드는 법 좀 알려주세요   12.04
pcr gel 결과가 이해가 안돼요.....   12.04
icc 면역세포화학에 대해서 알려주세요   12.04
TLC시 UV-vis 황산 사용 이유 궁금합니다.   12.04
건병증(tendinopathy) 모델을 찾고 있습니다.   12.04
RNA를 NFW에 희석해도 괜찮을까요?   12.04
미생물 멸균에 관해서 추가 질문 드립니다.   12.04
Bacillus subtilis glycerine stock 배양   12.04
제품평가
[바이오탭스]
Mini Magnet Virtical Electrophoresis System
바이오탭스
모집인원: 15명
모집기간: ~12/9까지
신청조건: BRIC 회원
평가자 혜택

- 참가자 전원 2만원 상품권 제공
- 평가후 평가제품 구매 시 알루미나 플레이트와 콤 5개 제공
- 우수평가자 3명에게 5만원 상품권 추가 제공

제품평가자 모집중
최근답변자 우수답변자
개구리동물연구

대왕개구리SPEED

알wodhks

알asefpjv

대왕개구리강시

알wodls

올챙이아무고토몰라요

개구리DTer

꽃개구리Jake

꽃개구리Baltimore

꽃개구리아라곤

개구리애니

개구리하늘을달려라

개구리ExDown's

개구리쿠나비

개구리지냐

실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
이제욱 연재중생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
머크 광고