실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
GAPDH band가 일정하게 나오지 않을 때
레벨1 아기고양이 (대학원생)
안녕하세요 저는 HaCaT cell에 식물 extract를 24h 처리한 뒤
RNA isolation하여 1ug으로 정량하여 cDNA를 합성한 후 rt PCR을 진행하였습니다.
sample은 UVB 무처리군 / 처리군 / positive control / UVB 조사 후 extract 농도별 3가지 이렇게 6개로 설정하였습니다.
저희 랩에서는 housekeeping gene인 GAPDH를 detect하기 위해 sample별 tube마다 cDNA를 1ul씩 넣고 pcr을 돌린 뒤
image lab을 통해 나타난 각각 band들의 volume값을 보고, 그 중 적절하다 싶은 band 1개의 volume을 1로 설정하여
그 값을 기준으로 다른 sample의 상대적인 값을 계산하여 나온 값을 토대로 cDNA 양을 sample마다 달리 하여 GAPDH band를 일정하게 맞춥니다
예)
Band No. | Band Label | Mol. Wt. (KDa) | Relative Front | Volume (Int) | Abs. Quant. | Rel. Quant. | Band % | Lane % | |
Lane 1 | 1 | N/A | 0.409091 | 20405000 | N/A | N/A | 100 | 100 | |
Lane 2 | 1 | N/A | 0.545455 | 12287310 | N/A | N/A | 100 | 100 | |
Lane 3 | 1 | N/A | 0.636364 | 17298254 | N/A | N/A | 100 | 100 | |
Lane 4 | 1 | N/A | 0.636364 | 20988773 | N/A | N/A | 100 | 100 | |
Lane 5 | 1 | N/A | 0.590909 | 27297360 | N/A | N/A | 100 | 100 | |
Lane 6 | 1 | N/A | 0.454545 | 27342675 | N/A | N/A | 100 | 100 | |
cDNA | 양 (ul) | ||||||||
20405000 | 0.8 | ||||||||
12287310 | 1.4 | ||||||||
17298254 | 1.0 | ||||||||
20988773 | 0.8 | ||||||||
27297360 | 0.6 | ||||||||
27342675 | 0.6 |
그런데 이 과정을 계속 반복해도 GAPDH가 도무지 일정하게 나오질 않네요..
GAPDH가 일정하게 잡혀야 그 다음 MMP 등 다른 factor들의 extract 처리에 따른 양상을 볼 수 있는데 이 단계에서 넘어가질 못하고 있습니다
cDNA 합성전 RNA의 260/280 purity도 괜찮았고, 합성 kit protocol대로 RNA 농도도 맞춰서 했고, loading할 때마다 skill 문제로 새는 문제도 없습니다
첨부한 사진은 normalization 완료한 결과 사진입니다. 명암 등 편집하였습니다.
고수님들 pcr 초보 좀 구제해주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ
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