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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 GAPDH band가 일정하게 나오지 않을 때
알아기고양이(대학원생)  | 10.27 10:40
첨부파일 파일첨부: 201026 GAPDH (normalization 완료, 그래도 안 일정함).jpg (21 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 저는 HaCaT cell에 식물 extract를 24h 처리한 뒤

RNA isolation하여 1ug으로 정량하여 cDNA를 합성한 후 rt PCR을 진행하였습니다.

sample은 UVB 무처리군 / 처리군 / positive control / UVB 조사 후 extract 농도별 3가지 이렇게 6개로 설정하였습니다. 

저희 랩에서는 housekeeping gene인 GAPDH를 detect하기 위해 sample별 tube마다 cDNA를 1ul씩 넣고 pcr을 돌린 뒤 

image lab을 통해 나타난 각각 band들의 volume값을 보고, 그 중 적절하다 싶은 band 1개의 volume을 1로 설정하여

그 값을 기준으로 다른 sample의 상대적인 값을 계산하여 나온 값을 토대로 cDNA 양을 sample마다 달리 하여 GAPDH band를 일정하게 맞춥니다

예) 

  Band No. Band Label Mol. Wt. (KDa) Relative Front Volume (Int) Abs. Quant. Rel. Quant. Band % Lane %
Lane 1 1   N/A 0.409091 20405000 N/A N/A 100 100
Lane 2 1   N/A 0.545455 12287310 N/A N/A 100 100
Lane 3 1   N/A 0.636364 17298254 N/A N/A 100 100
Lane 4 1   N/A 0.636364 20988773 N/A N/A 100 100
Lane 5 1   N/A 0.590909 27297360 N/A N/A 100 100
Lane 6 1   N/A 0.454545 27342675 N/A N/A 100 100
                   cDNA 양 (ul)    
          20405000 0.8      
          12287310 1.4      
          17298254 1.0      
          20988773 0.8      
          27297360 0.6      
          27342675 0.6      

그런데 이 과정을 계속 반복해도 GAPDH가 도무지 일정하게 나오질 않네요..

GAPDH가 일정하게 잡혀야 그 다음 MMP 등 다른 factor들의 extract 처리에 따른 양상을 볼 수 있는데 이 단계에서 넘어가질 못하고 있습니다

cDNA 합성전 RNA의 260/280 purity도 괜찮았고, 합성 kit protocol대로 RNA 농도도 맞춰서 했고, loading할 때마다 skill 문제로 새는 문제도 없습니다

첨부한 사진은 normalization 완료한 결과 사진입니다. 명암 등 편집하였습니다.

고수님들 pcr 초보 좀 구제해주시면 감사하겠습니다ㅠㅠㅠ

 

 

#GAPDH
 
#PCR
 
#house keeping gene
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.27 11:51  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

rt-PCR에서 GAPDH band가 첨부사진 처럼 차이가 나면 cDNA 합성에 문제가

있을 가능성이 보입니다.

또한 rt-PCR 30cycs이상 증폭하면 density가 동일하게 보이기 때문에 증폭양 비교를

하기 힘듭니다.

증폭량 비교는 realtime으로 분석하는 것이 좋고 1개 시료 당 1개 control을 pair로

실험해야 합니다.

또한 band density측정 방법에도 문제가 있어 보이는데 density측정에 control이 안

보이네요.

알아기고양이  |  10.28 18:37  

SPEED님 답변 감사합니다

혹시 피펫팅이 변수일까 싶어서 cDNA를 희석 후 PCR mixture에 넣는 cDNA volume을 1ul에서 5ul로 늘렸는데도

특정 sample만 증폭이 제대로 안 돼서 cDNA를 새로 합성하려 하는데요

혹시 동량의 cDNA를 넣었을 때 band가 약하게 나오는 sample만 재합성하고,

band가 뚜렷한 다른 sample의 cDNA는 그대로 사용해도 괜찮을까요?

이전에 합성하고 남은 RNA는 -70도에 보관하고 있었습니다

cDNA 합성 키트에 남아있는 양이 매우 소량인데 실험을 급하게 진행해야 하는 상황이라 질문드립니다

대왕개구리SPEED  |  10.28 19:20  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 특정 sample만 증폭이 제대로 안 돼서 cDNA를 새로 합성하려 하는데요

: cDNA 반응 문제가 아닌 RNA 시료 문제로 보입니다.

따라서 다시 cDNA 합성해서 사용해도 결과가 달라질것 같지 않습니다.

 

- 혹시 동량의 cDNA를 넣었을 때 band가 약하게 나오는 sample만 재합성하고,

band가 뚜렷한 다른 sample의 cDNA는 그대로 사용해도 괜찮을까요?

: 실험은 연결해서 진행하는 것이 좋습니다.

특히 single strand RNA, DNA는 냉동 보관을 하지 않고 연결해서 증폭하는 것이

좋습니다.

 

- 이전에 합성하고 남은 RNA는 -70도에 보관하고 있었습니다

: RNA는 -80도에 보관해도 불안정합니다.

전기영동 해보면 분리 직후 시료와 -80도 보관 시료 간에 차이가 많이 보입니다.

 

앞전 답변에서 설명했듯이 qPCR이 아닌 단순한 RT-PCR로 양 비교는 힘듭니다.

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