실험 Q&A Cell Biology > Cell Culture
최소액체배지배양
레벨1 진진찐 (대학원생)
안녕하세요
yeast실험을 하고있는 학생입니다. 제가 pRS425벡터를 w303a에 transformation한 셀을 키우고있습니다.
transformants같은 경우에는
YNB (Yeast Nitrogen Base)+Annunium Sulfate
+20% glucose
+CSM leu
* CSM supplement (아미노산 mixture) : CSM- (결핍 아미노산명) 배지에 streaking하고 3일배양> 5ml에 seed culture 3~4일 >50ml에 OD 0.25로 접종하여 6시간 후 OD 0.5
w303a같은 경우에는 YPD에 streaking하고 이틀배양>아래의 조성배지에5ml seed culture 3~4일>50ml에 OD 0.25로 접종하여 ?시간 후 OD 0.5
YNB (Yeast Nitrogen Base)+Annunium Sulfate
+20% glucose
+CSM leu+leu 100mg/L
근데 transformant같은 경우에는 더블링 타임이 6시간 정도로 계산이 되었고 w303a같은경우에는 비슷하거나 더 빠를 줄알았으나 12시간?정도 더블링 타임이 나옵니다.
-원래 w303a가 더 느린것인지 궁금하고
-그리고 같은 플레이트에서 싱글콜로니를 따 최소배지에 액체배양을 하는데 seed culture하였을때 이상하게 속도 차이가 심하게 나는거 같은데 원래 이런것인지 제가 잘못하고있는지 궁금합니다ㅜ
-또 관계없는 질문이지만 qPCR 하였을때 beta-tublin값이 20이하일때 신뢰도가 있다고 알고있는데 갑자기 21이상이되었습니다. cDNA양이 적어서 그렇다고 생각해 RNA를 다시뽑아 spec을 재보았을때 1000ng/μL로 충분한 양이 나왔고 cDNA를 아래 왼쪽 조성으로 70도 5분 ICE1분 뒤 오른쪽조성으로 넣어주고 37도1시간 94도 5분 합성시간을 가졌습니다. 그 후 qPCR시 5배희석하여 5μL 넣어주고 primer는 20pmol로 사용해주었습니다. primer도 일반 PCR을 한 결과 dimer가 나오진 않았고 농도가 적어보이는 밴드가 나왔습니다(아래 사진 오른쪽부분 beta-tublin annealing 56~60도 gradient PCR)..무슨 문제가 있을까요..ㅜ 답답하네요
Random hexamer |
0.5ul |
Oligo d(T) |
0.5ul |
RNA |
1~2 ug |
Ultra water |
Up to 12 ul |
5X RT buffer |
4 ul |
dNTP |
4 ul |
M-RT |
1 ul |
total |
20ul |
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