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질문 PCR protocol에 문제가 없나요??
개구리CLOVA(대학생)  | 10.22 10:22

실험실에서 사용하는 kit 중

Forward primer 1μL
Reverse primer 1μL
PCR buffer 2μL
dNTP 2μL
DNA polymerase 1μL
D.W 11μL
Sample DNA 2μL

이렇게 넣어서 Total 20μL을 만들어서 PCR을 돌리는데,

Sample DNA를 제외한 나머지들을
1.5mL tube에 '필요한 양 +1' 만큼 만든 후
18μL만 따서 PCR tube에 옮긴 후 Sample DNA를 넣는데..

미리 나머지를 섞어서 Stock을 만들어놔도 되는 걸까요??

PCR 온도 조건은 선행연구하셨던 분께서 맞추셨는데,
계속 밴드가 연하게 떠서 이게 문제인가 해서요..

#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.22 10:37  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

먼저 stock을 만들어 사용하려는 이유가 뭘까요?

stock을 만들어 한번에 사용하면 무방하지만 여러번 사용하기 위해 만들어

얼렸다 녹였다를 여러번 하면 좋지 않습니다.

여러번 사용하려면 glycerol 등을 넣어야 합니다.

한번에 모두 사용하는 것이 fresh한 상태에서 PCR 결과 확인이 가능합니다.

 

개구리CLOVA  |  10.22 10:42  

Stock은 한 번 만들고 나면 재사용하지 않고 버립니다.
제가 Protocol을 배우기로는 1μL 단위가 적게 들어갈 수 있어서??
그리고, 많은 샘플을 할 때에 시간 단축을 위해서라고 알고 있는데,
PCR tube마다 각각 해줘야되는 건가요??

개구리무광  |  10.22 11:15  

cloning이 아니라 검출이 목적이면 
3개월정도 냉장보관되는 Pre-mix taq 제품을 쓰셔도 될 거 같은데요

대왕개구리SPEED  |  10.22 11:18  

- PCR tube마다 각각 해줘야되는 건가요??

: 실험자 마다 tube 개수 기준이 다를것 같습니다만 1ul도 정확히 취할수 있습니다.

tube가 몇 십개가 된다면 시간 단축을 위해 1 tube에 혼합해서 사용해도 됩니다.

올챙이구상  |  10.27 00:05  

reaction mix를 만들 때 중요한 것은 넣는 용액의 부피가 아니라 농도입니다. 

 

1. Primer 1uL를 넣는 것이 10pmol을 말하는 것이 맞나요?

2. sample DNA 2uL는 매번 동일한 농도의 DNA를 기준으로 말하는 것인가요?

처음에 넣어주는 DNA의 총량이 예전과 다르다면 당연히 밴드의 밝기도 다르게 나올 수 있습니다. 농도와 실제 들어가는 양이 얼마인지 꼼꼼하게 확인하시기 바랍니다. 

 

하시는 연구 잘 되길 바랍니다. 

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