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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 Golden gate cloning 관련 질문 드립니다.. 꼭 부탁드려요.
올챙이볼빨간신입생(대학원생)  | 10.20 15:07
첨부파일 파일첨부: GG.png (659 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요~

현재 클로닝을 진행 중인 박사과정 2학기 학생 입니다...

 

기존에 클래식 클로닝을 진행하다가.. 결과가 좋지 않아서 최근에

goldengate cloning을 진행하고 있습니다.

 

우선 간단한 실험정보를 말씀드리면,

pUC19에 gram positive 유래 gene을 insertion시키는 것이 목표 입니다.

실험은,

golgen gate cloning 후 c.cell (DH5a)에 transformation 시켰고,

plating 후 37도에서 o/n incubation하여 colony를 관찰했습니다.

이번에 처음 진행하는 것이라 그런것인지 현재 나온 결과에 대해

해석이 불가한? 상태라 선배님들의 조언을 좀 구하고자 합니다...ㅜㅜ

 

결과 확인은

1) PCR (restriction-ligation) 후 mixture 1 ul를 gel에 loading하여 band check

2) transformation 후 colony 관찰

 

첨부사진은 1)에 대한 결과 입니다.

2)에 대한 결과는 LB w/ Amp100 plate에서 blue colony (LacZ 분해X) 99%와

white colony 1~2개 정도 발견

 

우선 제 생각은...

lacZ를 건드리지 않고 cloning 하였기 때문에 blue colony가 제가 원하는 결과라고 생각했습니다. 우선 blue colony들을 re-streaking 하였고, 그 후

LB배지에 (w/ Amp100) single colony만 접종하여 37도에서 o/n shaking incubation 시켰습니다.

그리고 mini prep. kit로 plasmid DNA를 추출하려고 했는데...

첨부한 사진과 같은 결과만 나옵니다...

cloning이 제대로 되지 않은 것인지... mini prep. 조건이 무언가? 맞지 않는 것인지... 잘 모르겠습니다.. 

#클로닝
 
#goldengate cloning
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.20 15:28  

이런 실험은 일반적인 cloning인데 잘안된다면 insert와 vector 준비에 문제가

있습니다.

ligation에 사용한 자른 vector와 insert 사진이 있나요?

올챙이볼빨간신입생  |  10.20 15:55  
첨부파일 파일첨부: Screenshot_20201016-082227_PowerPoint.jpg (403 KB)
이미지 첨부파일

답변 감사드립니다.

vector와 insert에 문제가 있다고 생각하는것이 먼저였지만

우선 최대한 pure하게 GP하고 single band 인것까지 확인은 했습니다.

cut한 사진 처음에 올린 그 사진입니다.
지금 첨부드리는것은
1) blunt end product PCR (linear)
2) golden gate (restriction-ligation) -첫 번째 업로드 한 사진
3) transformation
중에 1) 후 GP 하기전과 후의 사진 입니다.

대왕개구리SPEED  |  10.20 16:05  

정제 후 확인은 좀더 내려서 확인하세요.

insert는 별로 안좋은것 같습니다.

golden gate에 blunt end를 사용했나요?

클래식 cloning 할 때 어떤 효소 말단을 사용하나요?

 

올챙이볼빨간신입생  |  10.20 16:12  

제가 아는 golden gate cloning은 양말단을 blunt-end로 만들고

그 다음에 실제 PCR 기계에서 golden gate cloning이 진행 될 때

4개의 overhange을 중심으로 restriction-ligation되는 방법이라고 알고 진행했습니다.

 

네.. 제가 이번에 1 ul gel loading에서 충분한 시간을 두고 gel을 내리지 못했습니다..ㅠㅠ

insert 상태가 많이 안좋아 보이나요..?

 

대왕개구리SPEED  |  10.20 16:35  

전기영동 문제인지 깨끗하지는 않습니다.

올챙이볼빨간신입생  |  10.20 17:22  
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20201020_171807144.jpg (372 KB)
이미지 첨부파일

SPEED님, 답변 감사드려요~!

우선 말씀해주신 insert가 이상할 수 있다는 점 참고하겠습니다.

 

그런데 본문에도 말씀드렸다시피

transformation 후에 colony까지 관찰을 하였습니다..

colony가 나왔다는 것은

blunt-end product 2개가 붙어서 circular한 상태의 plasmid가 c.cell에 들어갔고

형질전환 되었다고 볼 수 있는 것 아닌가요..?

차라리 no colony 였다면 이런 고민이 들지 않을텐데; 그게 아니라서 좀 답답합니다... ㅠㅠ..

대왕개구리SPEED  |  10.20 17:26  

vector가 들어갔으니 colony가 나왔을 겁니다.

goldengate 실험은 전체 flow를 알수 없어서 뭐라 말하기가 힘드네요.

간단한 실험인데 클래식 방법으로 하면 한번에 바로 cloning가능할 텐데요.

올챙이볼빨간신입생  |  10.20 17:35  

vector만 들어갔다고 생각되지 않는게... 음

댓글에 적은 것 처럼

1) blunt-end PCR을 해서 product를 linear한 상태로 만듭니다.

vector끼리 ligation 되었다고 생각하지 않는 이유는  "1-2-3" 이런식으로 (설명이 좀 난해합니다^^;) vector와 insert의 양말단 overhang이 결합되도록 primer를 짜두었기 때문입니다....

 

linear한 vector만 c.cell에 들어가도 소용이 없지 않나요..?

 

classic cloning을 해보았는데.. ligation이 잘 되지 않았어요..

그래서 효율이 좋다고 하는 golden gate를 시도해보고 있습니다..

 

그리고 말씀해주신 insert가 pure하지 않은 부분은,

혹시 insert를 PCR로 해서 product를 얻은 후 GP를 하게 되는데

이때 GP를 좀 여러번 (gel->GP->Gel->GP)이런식으로 하면 좀 도움이 될까요..?

대왕개구리SPEED  |  10.20 18:31  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

colony는 5개 정도만 prep.해서 잘라보면 clone의 pattern을 알수있을 겁니다.

클래식한 cloning이 잘 안되면 실험 재료 준비에 역시 문제가 있다는 걸

반영합니다.

band를 gel 정제를 여러번 하면 수율이 많이 내려갈 겁니다.

한번에 잘되는 실험은 한번에 가능하도록 손에 익히는 것이 좋습니다.

올챙이볼빨간신입생  |  10.20 18:39  

네~! 답변 감사드립니다.

새로운 마음으로 cloning 재료들부터 다시 손보며 준비해보려고 합니다.

감사합니다!

꽃개구리느림보  |  10.20 22:49  

pUC19에 GoldenGate assembly에 사용할 수 있는 Type IIs 제한효소 인식서열이 없을텐데 무슨 제한효소를 사용했나요? 혹시 Fusion 기법이 아닌가요?

 

올챙이볼빨간신입생  |  10.21 09:01  
느림보님~
말씀이 맞습니다~ pUC19에서 golden gate에 사용할 수 있는 type IIS 인식 서열이 없어요.
말씀하신대로 fusion site를 이용했고, 이때 사용한 type IIS enzyme은 Bbsl를 사용했습니다~

pUC19과 insert 각각을 blunt end product로 얻으려고 각각 primer를 짰고 이때 이 primer 양말단에 pUC19이 갖고 있는 서열로 4 base overhang (이후 BbsI에 의해 인식될 부위) 과 BbsI의 서열을 넣어 PCR하여 fusion site를 만들었습니다.

혹시 golden gate cloning에 대해 조언해주실 수 있을까요..?
대왕개구리강시  |  10.21 09:11  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

우선 pUC19를 사용해야 되는 실험이 아니라면 다른 벡터를 사용하세요.

pUC 벡터에 insert가 5kb 짜리도 넣어보기는 했지만, 기본적으로 1kb 이하의 작은 insert를 클로닝해서 sequencing하는데는 사용하기 좋지만 그 이상 큰 DNA, 를 클로닝하는 것은 좋지 않습니다.

pBluescript 등을 사용해 보세요.

 

pUC는 copy number가 700 입니다. 대장균 한 마리가 4.6M 짜리 자기 genome 이외에 2.1Mbp 의 pUC DNA를 더 합성해야 하는데 insert가 들어가서 5kb 가 되면 3.5Mbp를 더 합성해야 합니다. 대장균이 이런 상태에서 복제하고 분열하는것 자체가 힘든 상황입니다. 그러니 copy number가 작은 vector를 사용하는게 cloning 효율을 높이는 방법입니다.

꽃개구리느림보  |  10.21 12:09  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

일반적인 의미로 사용한 거라면,

Fusion cloning은 blunt 말단일 필요가 없고, 또 overhang이 없어도 됩니다. NEB나 어디서 표준 프로토콜을 보시고 생각해보세요.

LacZ를 건드리지 않고 클로닝하게 설계하였다는 데서 짐작해보는건데, GeneX를 LacZ의 상위, 하위에 연결하기 위해서 기존의 multiple cloning site 말고 LacZ cds 밖에 프라이머를 두어 PCR 하고, 여기에 GeneX를 넣으려는 건가요? 

만약 지금 vector와 insert가 모두 blunt end로 PCR한 상태이고, BbsI overhang이 맞도록 프라이머가 붙어 있다면, pUC19 내부에 BbsI 자리가 없기 때문에 바로 GoldenGate assembly를 하면 됩니다. 

T4 ligase buffer, vector:insert (1:1), BbsI, T4 DNA ligase, BSA를 한데 넣고, 37도/23도 사이클링하시면 됩니다. 이렇게 해서 안나오면 프라이머 설계를 의심해 보세요. 아래 그림을 참조하면 좋을 듯 합니다. 

 

Team:BostonU/MoClo - 2014.igem.org

(출처: http://2014.igem.org/Team:BostonU/MoClo)

 

올챙이볼빨간신입생  |  10.22 20:57  

느림보님 답변 감사드립니다.

우선 LacZ를 건드리지 않은 이유는..

궁극적으로 제 실험의 목표는 gram positive가 이용할 수 있는  plasmids를 만드는 것입니다.

그래서 1차 목표인 이 실험은 pUC19에 gram positive에서 분리한 plasmid 중 이 plasmid가 가진 origin 부분을 insert로 사용하여 넣고, 이렇게 만들어진 plasmid를 다른 gram positive bacteria에 넣어서 replication이 되는지 확인하려고 합니다.

replication이 되면, 이때 다시 합성된 plasmid에 저희가 확인하고자 하는 gene을

cloning 해보려고 하는 것이 2차 목표입니다.

그래서 lacZ를 1차 목표에서 건드리지 않고, 2차 목표 실험시에 이용하기 위해

남겨 놓은 것입니다.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------

만약 지금 vector와 insert가 모두 blunt end로 PCR한 상태이고, BbsI overhang이 맞도록 프라이머가 붙어 있다면, pUC19 내부에 BbsI 자리가 없기 때문에 바로 GoldenGate assembly를 하면 됩니다. 

-----------------------------------------------------------------------------------------------------

=> 네, 이렇게 진행을 하고 있습니다.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------

T4 ligase buffer, vector:insert (1:1), BbsI, T4 DNA ligase, BSA를 한데 넣고, 37도/23도 사이클링하시면 됩니다. 이렇게 해서 안나오면 프라이머 설계를 의심해 보세요. 아래 그림을 참조하면 좋을 듯 합니다. 

-----------------------------------------------------------------------------------------------------

=> 우선 1차로 실험을 진행해본 것이 insert:vector (3:1)으로 나머지 재료를 넣고

37/16도에서 50 cycles로 진행했습니다.

이렇게 했을 때, 답변 중 첨부한 blue colony를 확인할 수 있었습니다.

그런데... 문제는; 이  blue colony를 따서 inoculation -> mini prep. 했는데..

plasmid를 얻지 못했습니다;;; 이 부분이 이해가 잘 가질 않습니다.

ligation이 되었고, c.cell에 plasmid가 들어갔고 pUC19이 가진 lacZ가 이용되지 않아 blue colony가 떴을 것이라고 생각했는데.. prep.을 했는데 pUC19의 band조차..? 나오질 않아서 정말 의아합니다..

그래서 혹시나 하는 생각으로.. 

어제 ligation 비율을 insert:vector (2:1), (1:1)로 하여 각각 transformation을 진행했습니다. (내일 콜로니 확인 예정입니다..)  

 

말씀하신대로 이렇게해서도 나오질 않으면.. 프라이머를 의심해 봐야 하는데

원하는 사이즈의 타겟 밴드 (insert+vector ligation 되었다고 생각하는 사이즈)를

확인했고.. blue colony까지 확인했는데 왜 이런 현상이 일어나는지 모르겠습니다..

후 우선 내일 콜로니부터 다시 확인해보려고 합니다.

 

답변 주셔서 정말 감사드립니다. ^^

 

꽃개구리느림보  |  10.26 01:16  

다른 추가 실험을 하기 전에, 생각을 더 해보세요. 

GG assembly를 했기 때문에, blue colony는 2가지 경우의 가능성이 있습니다.

하나는 제대로 insert가 들어간 것이고, 나머지는 반응이 안되어서 벡터가 그대로 나온 경우겠죠. 어떤 경우에든 blue는 lacZ 유전자가 발현된 것이기 때문에 플라스미드가 나와야 합니다. 

prep해보기 전에 colony PCR로 선발을 먼저 해 보시기 바랍니다. 지금 디자인에서는 두 가지의 가능한 경우를 구분할 수 있는 선발마커가 없기 때문에 이후의 수고를 덜기 위해서 colony PCR로 라도 걸러내는 게 좋겠지요. 

무엇보다 plasmid 가 나오지 않았다는 건 넌센스입니다. 어쩌면 액체배지에서 항생제가 잘 안먹힌 건 아닌가 싶기도 하네요. 항생제를 새로 듬뿍 100mg/L 이상 넣어서 접종을 다시 해보세요. 안나올리 없어요. 

올챙이볼빨간신입생  |  10.26 10:13  

느림보님 안녕하세요~!

안그래도 오늘 아침에 결과를 확인해봤는데

GG assembly -> transformation -> blue colony check -> inoculation (LB broth w/ Amp 100) -> inoculation 확인 (잘 자라지 않음..)

 

안그래도 colony 접종 후 잘 자라지 않아서... 항생제를 제대로 안넣었나? 생각해봤는데요;

Amp 100 mg/ml stock solution으로 만들어서 사용하고 있고,

이를 100 ug/ml로 final con.로 되게 LB broth에 넣고 접종했습니다.

 

blue colony가 나온 것에 대해서는 .. 우선 제 생각은

vector 끼리 self-ligation이 되지 않게 design 했기 때문에 blue colony들은

vector에 insert가 들어간 colony라고 생각합니다.

 

안그래도 지난 주에 colony PCR도 진행을 해보았는데 ligation 후 band 확인 시에는 insert+vector= 5.1 kb 부근에서 band를 확인했고,

colony PCR 후에 gel에서 확인 했을 때는 5~6 kb의 product가 증폭된 걸 확인했습니다.

 

지금.. 문제는 1) inoculum이 늦게 자라는 것, 2) inoculum에서 plasmid가 나오지 않는 것.. 입니다.

저도 plasmid가 나오지 않는게 말이 안된다고 생각합니다.. 미치겠네요 허허...ㅠㅠ

 

혹시 관련해서 도움을 좀 부탁드려도 될까요..? 강시님, 느림보님..

실례가 안된다면 쪽지 부탁드립니다. 감사합니다.

꽃개구리느림보  |  10.26 12:11  

2-cut을 해도 vector self ligates가 생깁니다. 그 이유는 ... 3천몇백가지... 인가 그렇습니다. 그래서 선발을 잘 하는 것이 중요해요. 

 

문제1,

colony PCR로 5kb 이상을 확인하는 게 가능한지? 만약 밴드가 보였다면 그건 증폭된 DNA가 아니라 genomic DNA라던가, plasmid 자체였을 겁니다. colony PCR은 1kb 이내가 되도록 프라이머를 설계해서 써야 해요. 벡터쪽에 하나, insert쪽에 다른 하나가 위치하도록 하면 벡터에 삽입된 방향까지 고려해서 선발할 수 있겠죠. 아래 그림의 오른쪽을 보세요.

 

What is colony PCR?

(출처: https://geneticeducation.co.in/what-is-colony-pcr/)

 

문제2) origin ?

제가 중간 내용을 잘 이해하지 못했습니다. 지금 gram positive origin을 pUC19의 ori를 대신해서? 아니면 추가로 넣어서 dual origin이 되는 건가요? 넣으려고 하는 ori가 E. coli에서 잘 작동하는건지? 

올챙이볼빨간신입생  |  10.26 13:13  

제가 중간 내용을 잘 이해하지 못했습니다. 지금 gram positive origin을 pUC19의 ori를 대신해서? 아니면 추가로 넣어서 dual origin이 되는 건가요? 넣으려고 하는 ori가 E. coli에서 잘 작동하는건지? 

---------------------------------------------------------------------------------------------------------

dual origin이 맞습니다~ 최종 목표는 E.coli에서 잘 작동하는지는 아니고

gram positive bacteria에서 작동하는 ori를 확인하기 위함입니다.

 

 

근데 궁금한게 있습니다.

GG assembly 할때.. vector를 cut해서 얻지 않았고, vector의 양 끝 overhangs을

서로 binding되게 디자인하지 않았는데도 self-ligation을 염려해야 하나요..?

 

blue colony로 inocluation을 진행했을 때 잘 자라지 않는다고 했는데

7개의 tube 중에서 3개는 잘 자라서 일단 cell down 시켜서 plasmid mini prep.을

해보려고 합니다.

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