건조가 잘되는데 이해가 안되네요.
호일을 덮어 37도 인큐베이터나 heat brock에서 10분
정도있으면 건조됩니다.
1. 1.5mL E-tube에 담긴 RNA를 75% ethanol (1mL)에 washing (vortexing)하고 7500g / 4c / 7min centrifugation을 돌림
2. 상등액을 따라버리고, 다시 7500g / 4c / 1min centrifugation을 돌림
3. 남아 있던 액체를 pipette tip으로 조심스럽게 제거.
4. 그냥 상온에 2-3분 두면 완전히 마릅니다.
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레벨2
wassupyall
(대학생)
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20.10.19 10:19
답변 감사합니다!!
또 다른 질문이 생겼습니다.
1. RNA가 보통 불안정한것으로 알고 있는데, 37C incubator나 heat brock?을 사용하면 RNA가 깨지거나 purity/conc.에 안 좋지 않나요?
감사합니다!!
RNA는 DNA 보다 불안정합니다.
그래서 온도를 놓일때도 60도 이상은 올리지 않아야 손상을 방지할 수 있습니다. Northern blotting을 할 때, RNA를 labelling 할 때 아주 고온에서 처리;하지 않는 이유가 온도에 약하기 때문입니다.
RNA는 acid에 강하지만 alkali에 약합니다.
plasmid prep할때 Solution 2 단계에서 DNA는 안정하지만 RNA가 대부분 degradation 되는 이유가 solution 2에 들어 있는 NaOH 때문입니다. 반면, RNA prep할때 hot phenol을 처리하면 DNA와 protein은 dergradation되어도 RNA는 안정합니다.
또 다른 이유는 RNase가 매우 stable한 효소라서 그런건데요.
Rnase는 열변성을 시켜도 온도만 떨어지면 쉬 reactivation 됩니다. 그래서 샘플에 조금만 남아 있으면 RNA를 다 아작내버리기 때문에 RNA를 불안정하게 느껴지게 만듭니다.
안녕하세요 작년의 저의 상황이네요
RNA실험 초반에 RNA가 dry되지 않아 애먹은 적이 있습니다.
1시간동안 상온에 뒀는데도 하얗게 있어서 dry가 안되었다고 생각했는데 건드려보니 파사삭 부서졌습니다. 여러번 실험을 해도 이러한 현상이 반복되길래 여러 방법을 동원해 dry해도 pellet이 투명해지지 않았고 박사님도 이상하다 하신 기억이 있네요.
저의 경우에는 RNA isolation과정에서 수층 분리시 깔끔하게 RNA만 따지 못해 그랬습니다. (단백질이나 glucagon이 섞여 들어가면 pellet이 하얗게 되는데 glucagon의 경우 물에 잘 녹지만 단백질이 같이 따라 들어오면 물에 잘 녹지 않아요)
그래서 욕심을 버리고 수층의 3/4으로 줄여서 따고, ETOH washing시에도 salt제거를 위해 pellet을 부숴 (Vortex를 하셔도 좋고, 앞뒤로 튜브를 흔들어도 잘 부숴집니다.) EtOH따니 pellet이 잘 녹더라고요. 혹시 저처럼 다른 오염물질이 따라 들어갔거나, washing이 잘 이뤄지지 않은 거라면 도움이 될 것 같아서 답변 남김니다^-^
그 외에도 google에 RNA Trouble shooting이라고 검색해보면 더 많은 정보를 얻을 수 있을 거에요 대학원생활 화이팅하세요
Trizol을 이용한 층분리법이 굉장히 오래 사용된 RNA추출방법은 맞습니다만
중간층을 건드리지 않고 상층액만을 얻는것은 매우 어려워 그 부분에서 중간층 혼입으로인한 문제가 많이 발생합니다(잘못하면 더 아래 부분도 딸려오지요)
그리고 아주 잘 뽑았다고 해도 Phenol성분이 남아있는경우가 많아 민감한 NGS급 실험을 하기에 부적절한 RNA 퀄리티를 가지고 있는경우도 많습니다.
다른 팁들은 다른분들이 많이 말씀해주셨기 떄문에 넘어가고 Triozol같은 Phenol류 시약에서 RNA추출시 꼭 층분리만을 고집하실 필요는 없습니다. 요즘은 Trizol에서 층분리 없이 RNA를 Column으로 추출하는 키트도 나와있으니까요. 애초에 중간층 혼입을 막으려면 이런 제품(https://www.zymoresearch.com/collections/direct-zol-rna-kits)도 참고하세요