현재 I.P 실험을 진행하고 있는 중 인데요,

실험을 진행하던 중 5X sample buffer를 다 써서

기존 buffer가 Protein Method 책의 recipe로 만들었다하여,

1M Tris-HCl (pH 6.8)       60mM     : 0.6ml
50% Glycerol                    25%     :  5ml
10% SDS                           2%     : 2ml
β-mercaptoethanol            5%     :  0.5ml
1% Bromophenol blue      0.1%     : 1ml
3차 D.W                                      : 0.9ml        total 10ml

protocol을 참고하여, total 10ml로

(0.5M Tris (ph6.8) 1.2ml, 99% glycerol 2.5ml, 20% SDS 1ml로 stock 이용)

새롭게 5X sample buffer를 만들어 western을 진행 했습니다.

사진에서 보시다 싶이 SDS-PAGE loading에서 부터 sample 끌림이 나타났으며,transfer 후 membrane 위에도 단백질로 추정되는 덩어리들이 묻어 있고, 퐁슈로도 확인 되었습니다.

detection 시 당연하게 새로만든 sample buffer를 넣은 sample들은 아무런 band도 확인 할 수 없었습니다.

(왼쪽 3개 well은 I.P sample, 제일 오른쪽은 이전 sample buffer positive tagging sample 입니다.)

기존에 이미 반복했던 실험이어서 band가 나오는 것을 확인 하였기 때문에 sample buffer에 문제가 있다고 확신하는 중입니다.

stock에 문제인가 싶어, 1M Tris-HCL(ph6.8)은 다시 만들고, 10% SDS는 제품을 이용하였으나, 다시 만든 sample buffer도 끌리는 현상이 나타났습니다.

어떤 시약 때문에 protein이 aggregation되어 loading이 되지 않는지 답답하네요