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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 SDS-PAGE시 sample이 well에서 끌리는 현상이 나타납니다.
올챙이빈님(대학원생)  | 10.15 17:01
첨부파일 파일첨부: western error.pptx (1.89 MB)

현재 I.P 실험을 진행하고 있는 중 인데요,

실험을 진행하던 중 5X sample buffer를 다 써서

기존 buffer가 Protein Method 책의 recipe로 만들었다하여,

1M Tris-HCl (pH 6.8)       60mM     : 0.6ml
50% Glycerol                    25%     :  5ml
10% SDS                           2%     : 2ml
β
-mercaptoethanol            5%     :  0.5ml
1% Bromophenol blue      0.1%     : 1ml
3차 D.W                                      : 0.9ml        total 10ml

protocol을 참고하여, total 10ml로

(0.5M Tris (ph6.8) 1.2ml, 99% glycerol 2.5ml, 20% SDS 1ml로 stock 이용)

새롭게 5X sample buffer를 만들어 western을 진행 했습니다.

사진에서 보시다 싶이 SDS-PAGE loading에서 부터 sample 끌림이 나타났으며,transfer 후 membrane 위에도 단백질로 추정되는 덩어리들이 묻어 있고, 퐁슈로도 확인 되었습니다.

detection 시 당연하게 새로만든 sample buffer를 넣은 sample들은 아무런 band도 확인 할 수 없었습니다.

(왼쪽 3개 well은 I.P sample, 제일 오른쪽은 이전 sample buffer positive tagging sample 입니다.)

기존에 이미 반복했던 실험이어서 band가 나오는 것을 확인 하였기 때문에 sample buffer에 문제가 있다고 확신하는 중입니다.

stock에 문제인가 싶어, 1M Tris-HCL(ph6.8)은 다시 만들고, 10% SDS는 제품을 이용하였으나, 다시 만든 sample buffer도 끌리는 현상이 나타났습니다.

어떤 시약 때문에 protein이 aggregation되어 loading이 되지 않는지 답답하네요

 

 

#SDS-PAGE
 
#sample buffer
 
#loading
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.15 17:36  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

나와있는 sample buffer 조성은 5X가 아니라 1X 입니다(glycerol 제외).

알거북이  |  10.15 18:04  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

이미 반복했던 실험이라고 하셨는데, 샘플을 다시 준비하고 새로운 sample buffer에 하신건지요?

제 생각엔 샘플을 준비하는 과정에서 denature가 되지 않았거나, 다른 여러가지 이유로 단백질 자체가 문제가 생겼을 것 같습니다.

연구실에 BSA와 같은 정제된 단백질을 새로 만든 sample buffer에 넣어 PAGE로 확인해보시면 어떨까요?

올챙이빈님  |  10.16 11:17  

SPEED 님

책에 나와 있는 조성대로 넣으면, 5x 최종 농도가 기재 된 대로 되는 것 아닌가요?

10ml기준, 1M Tri-HCI(ph6.8) 0.6ml을 넣으면 최종 60mM의 Tri-HCI이지 않나요?

그래서 최종 1x sample은 12.5mM 되는 것으로 이해 하였습니다.

올챙이빈님  |  10.16 11:19  

거북이님

sample은 새롭게 준비하여 들어간 상황이구요,

추측이지만, protein양이 많을 수록 저런 끌림현상이 강한 것 같습니다.

말씀해 주신대로, BSA를 가지고 농도별 control을 추가해

확인 하는 것도 방법일 것 같습니다.

대왕개구리SPEED  |  10.17 10:48  
시약 만드는 것은 항상 복수의 자료를 가지고 조성을 비교하는 것이 좋습니다.

1X tris buffer의 경우 60mM입니다.

경우에 따라서 80mM을 사용하는 문헌도 있습니다.

우선 sample buffer가 잘못 되었으니 다시 만들어서 실험해 보세요.

단백질 양은 문제가 없습니다.

불안정한 단백질도 sample buffer와 혼합하면 잘녹습니다.
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