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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 밴드 끌림 현상
개구리동물연구(과기인)  | 10.15 10:30
첨부파일 파일첨부: 20201015_101201.jpg (288 KB)
이미지 첨부파일

지노타이핑을 하고 있는데 사진 처럼 끌림 현상이 있고

밴드 사이즈가 나오질 않고 있습니다.

사이클은 40사이클 정도 로 2시간 30분 ~40분 진행 합니다.

 

어떻하면 밴드가 잘 나올 수 있을 까요..ㅜㅜ

고수 분들의 조언이 필요합니다.

#PCR
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  10.15 12:44  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

우선 template의 양을 1/10 - 1/100 정도로 줄여서 PCR을 해 보세요.

annealing temperature도 gradient로 해 보시면 뭔가 답을 얻을 수도 있습니다.

개구리동물연구  |  10.15 15:55  

그러니깐..PCR 을 희석하라는 건가요?

 

그리고 온도 설정을 해보라는 거죠?

아닙니다  |  10.15 16:55   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

여기서 template는 genomic DNA입니다.

개구리동물연구  |  10.16 10:29  

일단 DNA 양은 3ul로 줄여서 넣었구요.

Taq은 기본이 0.5인데 1 넣었습니다.

그리고 에널링.. 1도 낮추었습니다. 원래 64도 인데 63도 로요.

 

이렇게 했는데도 밴드가 끌리거나 밴드가 안 나오면 어떻게 해야 할 까요..ㅜㅜ

개구리동물연구  |  10.16 15:36  

그대로 끌림 현상이 있습니다.

 

어떻게 해야 할 까요?ㅜㅜ..

제 생각에는 다른 건 문제 없고, 프라이머가 의심 됩니다.

DODOREAM  |  10.17 00:13   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

문제점을 명확히 알아야 해결책을 알 수 있습니다.

1. DNA ladder도 명확히 보이지 않는 문제점

2. extracted genomic DNA 를 그대로 loading한 것과 비슷한 양상을 보임

제가 찾을 수 있는 현상학적 문제는 두가지 입니다.

1번 문제는 buffer의 농도와 DNA ladder의 buffer 농도가 서로 달라 생기는 문제일 가능성이 높습니다. (쓰시는 buffer와 DNA ladder를 같은 volume 으로 1:1 희석을 하신다음 volume을 2ul 정도만 따서 loading 해 보시길 추천드립니다.)

2. PCR이 이뤄지지 않았습니다. 

 - 가장 기본적으로 Forward primer와 Reverse primer의 sequence를 확인해보시길 바랍니다. 주문하는 과정이나 여타 실수로 인해 sequence가 잘못되어 PCR 과정이 일어나지 않을 수 있습니다. (해당 확인 필요 정보로는 sequence에 GC 비율 (따라서 Tm 값도 체크)

-primer dimer 문제. (그렇지만, 위 gel에서는 primer dimer나 PCR시 primer를 너무 많이 넣을 때 생기는 20~40bp 사이의 두꺼운 밴드가 보이지 않기 때문에, 해당 문제는 아닌 듯 합니다.)

-PCR 조건을 한번더 체크해 보시길 바랍니다. (이론적인 cycle에서 벗어난 부분이 있는지)

3. 전 날 많이 loading을 진행하였다면, 그 다음날은 항상 buffer를 새로 만들어 주세요.

 - loading을 하면 열에너지가 발생하여 물을 증발시키게 되고, 이로인해 buffer의 농도가 높아지는 악순환이 발생하는데, 이 농도와 gel 만들때 사용하는 새롭게 만든 buffer의 농도가 맞지 않을때 위와 같은 일이 발생하기도 합니다.  (PCR은 정확히 이뤄졌을 때 해당 문제에 의해 끌림이 발생합니다.) 

4. 위와 같은 gel이 찍히는 가장 근본은 내가 정확히 했다는 나만의 믿음 입니다. 

  -primer를 넣을때 Forward 넣고 Reverse를 넣었다 생각하지만, 잠깐의 집중와해로 인해 Reverse를 넣지 않는 등의 실수를 할 수 있습니다. 

5. 많은 공을 들여 시간을 들여 진행했지만 결과가 좋지 않다고 해서 실망하지 마세요.

   모든 과정을 연구노트와 함께 하세요. (실험시 간단 명료한 체크 리스트를 꼼꼼히 만들어 하나씩 체크하면서 진행하세요. 많은 도움이 될 겁니다.) 

6. 이에 대해 진지하게 고민을 나눌 수 있는 선배를 곁에 두세요. 같은 실수를 하고, 같은 현상을 숱하게 봐오면서 모든과정에서 당연한게 없다는 것을 터득한 선배일 수록 많은 도움이 될 것 입니다. "안될리가 없는데~ 너가 뭘 잘못했겠지~ "는 큰 도움이 되지 않을 수 있습니다. 

DODOREAM  |  10.17 00:16   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

아, 추가적으로 DNA 는 양이 중요한 것이 아니라 농도가 중요합니다.

농도가 매우 높다면 PCR이 저해될 수 있습니다.

농도가 예를들어 100ng/ul라면 이를 희석하여 10ng/ul, 1ng/ul로 만든다음 진행해보세요.

개구리동물연구  |  10.19 17:38  

40 사이클로 프라이머를 3개로 줄여서 했더니

 

윗 부분이 살짝 끌리는 것이 없어졌습니다.

 

DDW 50ul 와 샘플 2ul 희석하여 내일 한번 도전해 보겠습니다.

 

사이클도 늘릴 생각입니다.

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