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질문 물질 처리 이후 cell viability 급감
알wassupyall(대학생)  | 10.13 16:03

안녕하세요, 석사 1학기차인 대학원생입니다.

현재 SW480 셀에 물질 처리를 하여 노화 마커를 보는 실험을 하고 있습니다.

어제 12 well plate에 well당 1x10^5 cell seeding을 하고 (viability 좋음), 오늘 오후 물질 처리를 했는데 둥둥 떠다니는 셀(죽은걸로 추정)이 너무 많아졌습니다… 아침에만 해도 상태가 좋았고, 대부분 잘 부착된 상태였습니다.

Protocol

seeding한 배지 제거 à PBS washing à 물질 처리 (DMSO로 희석한 stock solution을 배지에 1:1000비율로 희석) à Shaking + tapping 입니다.

셀이 고르게 분포가 안돼서 약간 세게 shaking을 했는데, 이게 원인일까요??

물질 자체가 세포독성이 강하지도 않고, 이전 실험에서도 이런 일은 없었는데, 도대체 왜 상태가 급감했는지 모르겠습니다 ㅠㅜ 도와주시면 감사하겠습니다!!

 

#sw480
 
#물질처리
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리엑스트라  |  10.14 09:56  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

protocol은 아래 내용 고려해보세요~

 

1. seeding한 배지 제거

2. PBS washing

3. 물질 처리 (DMSO로 희석한 stock solution을 배지에 1:1000비율로 희석)

4. Shaking + tapping

 

-->

 

1. seeding한 배지 제거

2. PBS +/+ 1mL washing

3. 배지 x mL(원래 양) 넣기 (이 때 FBS free로 하실 것 같구요..)

4. 배지 x mL 1/1000만큼 volume으로 물질 처리 (배지 0.5mL이면, stock 0.5 uL)

   control은 같은 volume의 DMSO 처리

5. tilting(위아래 흔들기x3, 좌우로 흔들기x3, 평행하게 흔들기)

 

그리고 고르게 분포가 안되었단 뜻은 confluency가 최적 조건으로 안되었고, 깔아줄 때 titing 등의 이유로 고르게 안 깔렸다는 뜻으로 보입니다...

보통의 실험에서 confluency가 너무 낮으면 실험 결과가 좋지 않고 고르게 깔리지 않은 단점이 있습니다. confluency는 실험 전에 90%가 가장 healthy한 조건입니다. 90% 일 때는 잘 안 떨어지기도 하죠..

 

그리고, 물질을 1/1000로 바로 희석하게되면... DMSO effect는 적어서 좋긴 한데..파이펫 용량이 너무 적어서 비추입니다... 1~2uL는 써야 하실 것 같구요.

배지 0.5mL이면 1uL 정도로 쓸 수 있게... stock을 다른 멸균된 ep tube에 1차로 1/2 희석(DMSO)하신 후 배지에 1/500 (1uL)로 처리하심이 나을 것 같아요. 

 

이렇게 댓글을 달아도 이런 댓글이 정황 파악이 안된 상태에서 드리는 것이니 단서 모으는 용도로만 이해해주시면 좋겠습니다.

알wassupyall  |  10.14 11:33  

답변 감사드립니다!!

상하좌우 + 8자로 shaking을 하는데, 그래도 셀이 중앙에 모여있을때도 있습니다 ㅠ 그리고 고르게 분포된 상태에서 incubation을 하고 다음날 아침에 보면 또 다시 중앙에 모여있는 경우도 있는데, 왜 이럴까요? ㅠㅜ.. 

Shaking을 조금 더 살살, 느리게 하면 될까요? 아니면 다른 좋은 방법이 있을까요?

감사합니다!!

  

대왕개구리SPEED  |  10.14 11:40  

seeding하고 몇 시간 후에 처리했고 처리한 농도가 MTT에서 viability가

어느정도 나오나요?

알wassupyall  |  10.14 12:27  

1. 1차시도는 cell seeding 후 대략 18시간, 2차시도는 seeding 후 대략 12시간 입니다.

SW480 셀은 seeding 후 incubation 시간을 더 늘려줘야 할까요?

2. 물질 처리 이후의 cell viability를 말씀하시는 건가요? 그건 아직 안해봐서 모르겠습니다 ㅠ

Cell seeding할 때의 viability는 ADAM-MC AccuChip kit를 사용해서 측정했고, T-N 측정시 viability는 1차: 84%  2차: 96% 나왔습니다.

2차 시도에서 96% 정도면 만족스럽게 나온거라 생각하는데, treatment 이후 마찬가지로 떠다니는 셀 (죽은것으로 추정)들이 많아졌습니다 ㅠ

대왕개구리SPEED  |  10.14 12:40  

cancer cell은 18시간이면 잘 붙을 겁니다.

잘 안붙은 상태에서 처리된 것 같지는 않습니다만 처리 직전 cell 사진이

있나요?

처리하는 물질의 농도 별 독성을 우선 확인 후 실험을 하는것이 좋습니다.

개구리엑스트라  |  10.14 16:19  

multi-well plate는 작을 수록 상하좌우로 빠르게 흔들어주셔야 하구요..

 

저도 사실 탭핑해본적은 있는데 데미지 입어서 실험 결과가 틀어진 적은 없었구요. (세포가 틀리고, 실험실도 틀리고...상황이 틀리니.......)

 

일단, 해당 내용은 실험 전체가 고르게 되도록..하기 위한 테크닉 정도이니 참고하세요..

 

문제는 다른 데 있지 않을까 싶습니다.... 

개구리엑스트라  |  10.14 16:21  

그리고 틸팅은...상하좌우로 흔드는것은 공중에서 하지 마시고..

BSC 바닥에서 소리가 좀 나더라도 바닥에 대고 상하좌우로 해보세요..

 

공중에서 하면 상하좌우로 해도 그냥 shaking효과로 가운데 몰릴 수 있어요.

 

그리고 attach cell들은 바로 현미경 확인하는 거랑, 몇 시간 후 가라앉은 뒤 보는 것이 다를 때가 있어요...

 

제 경우는 가운데 안 몰리고 대부분 벽에 있었죠-_-;

개구리엑스트라  |  10.14 16:25  

세포 문제라기 보다 물질 유효기간이 끝났을 수도 있습니다.

 

 

이전에는 잘 되었는데 이번에는 안된다라고 했을때,  세포는 거의 동일하게 준비했는데 이번에 안된건........세포는 프레쉬하게 준비했으나, 물질은 냉동고 보관하던거 꺼내 썼다로 이해됩니다.

 

물질은 stock solution 만들고 전부 aliquot해서 냉동 보관하고, 실험 시 마다 하나씩 꺼내 쓰셨는지, 혹은 하나의 stock만 만들어서 그때그때 녹여서 쓰고 다시 얼렸는지.......틀리죠....

 

그리고 냉동 보관한다해도 냉동고 자체가 성애가 끼지 않는 냉동고일 경우, 액체가 마르는 수가 있습니다. 그때는 농도가 증가하죠..

 

물질의 정량이 가능한 랩실이면 정량 해보는 것을 추천하고, 물질 자체도 새것을 써보심을 추천합니다.

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