Gibson assembly를 이용해 원하는 cloning을 하고자 하시는 것 같습니다.
mixture를 만들어서 사용하시는지, 아니면 master mix를 구매해서 사용하시는지 모르겠습니다. 중요하지는 않지만...
1. Gibson assembly 를 하고 product를 agarose gel에 내리고 gel purification을 한다는 말씀인가요? 본 내용은 사용하시는 gel extraction kit의 메뉴얼을 확인해보면 더 자세히 알 수 있겠지만, 아는 선에서 말씀드리겠습니다.
a) dissolving buffer가 부족하면 gel이 잘 안녹을 수 있습니다. 충분히 gel이 녹을 수 있을 만큼의 buffer를 넣어주어야 합니다.
b) Dissolving buffer pH는 잘 모르겠네요. 만들어 쓰시는지?
c) 주로 EtOH wash step이 있는데, 이는 salt를 없애주는 역할을 합니다. 또 유기 용매를 없애는데 도움이 되는 과정입니다. 이를 건너뛰면 260/230 ratio가 낮게 나올 수 있습니다.
d) Elution buffer가 산성이면 DNA 보관에 당연히 좋지 않겠죠. Degradation / sharing 등의 문제가 있을 것 같습니다.
2. 깁슨 어셉블리 할시 처음 recovery of DNA fragments 를 할때 gel photography 를 보면 dna 밴드가 PCR 해서 얻은 agrose gel electrophoresis 보다 더 흐릿한데 이게 무엇을 뜻하고 왜 그런건가요?
- 양이 적은것입니다. 밴드의 밝기는 그거 이외에 큰 의미는 없습니다. 당연히 PCR은 cycle이 돌아갈 때마다 product가 지수급으로 증가하니 밴드 세기가 높을 것 같습니다. 이런 류의 질문은 질문 올릴 때 이에 대해서 PCR cycle / loading한 DNA 농도 or 양 / gel % / gel image 등을 같이 올려주셔야 정확한 답변이 가능합니다.
3. 나노드랍 시에 얻은 purified vector 이랑 insert 의 DNA concentration 값은 어떻게 구하나요? 깁슨 어셈블리 시에 필요한 DNA 양을 구하는 법을 알고싶습니다!
1) 나노드랍을 통해 해당 샘플의 농도 / 양을 알아냅니다
2) backbone vector:insert fragment 비율을 정합니다. 당연히 moral ratio로 정하므로, 길이에 따라서 달라집니다. (주로 1:3~1:6 사이로 정합니다)
http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation
위 링크 (NEBio calulator)를 이용하면 쉽게 계산할 수 있습니다.
- 우리 실험실의 경우, gibson assembly 후 바로 transformation을 해서 positive clone을 얻은 후 불려서 사용합니다. PCR band를 이용해서 product를 확인할 수 있지만, 제일 정확한 것은 sanger sequencing을 보내서 실제 sequence를 읽어보는 것입니다.