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virus 용 vector(pX601 CRISPR)를 virus 로 제작하지 않고 in vitro 에서 transfection 시 working 을 하지 않는 경우도 있을까요?
레벨1 subiology (대학생)
안녕하세요
CRISPR vector pX601 을 이용한 연구를 진행중인 대학원생입니다.
In vitro 에서 해당 벡터가 워킹하는지 확인하는 단계에 있는데요,
처음엔 AAV 제작용 gene ITR 이 빠진 pX458 vector 로 진행을 했었고 HT22 cell line 에 transfection 후 CRISPR system 으로 인해 mutation 이 잘 일어남을 확인했습니다.
그런데 나중에 ITR 이 추가된 pX601 vector를 가지고 똑같은 방법으로 실험을 진행하였으나 working 을 하지 않는 문제가 생겼습니다.
Reporter gene 인 GFP 는 잘 발현되었고 이를 이용해 transfection 후 해당 vector 를 발현하는 cell 만을 sorting 하여 확인한 것인데 CRISPR 로 인한 mutation 은 일어나지 않았습니다..
두 백터의 차이점은 ITR 의 유무와 promoter 위치가 달라 gene 발현 순서가 다른 것 밖에 없습니다.
혹시 virus 용 vector 를 virus 로 제작하지 않고 in vitro 에서 사용 시 working 을 하지 않는 경우도 있을까요?
Vrius 용인 pX601 을 cell line 에 transfection 한 다른 스터디들이 있긴 한데 사용한 cell line 이 달랐습니다. 주로 HEK293T 같은 human cell line을 주로 이용했고, 저희는 mouse hippocampus neuron 인 HT22 에서 확인하려고 합니다.
Cell line 에 따라 vector 발현이 달라지기도 할까요?
저희 랩 박사님께서는 이론상 두 백터의 워킹에 차이점이 없는게 맞다고 하시는데 혹시 저와 같은 문제를 겪었던 분들이 있으신지, 해결 방법이 있으셨는지 궁금합니다.
작은 코멘트라도 도움 주시면 감사하겠습니다..
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