- 23.2 KDa 이던 단백질이 pET26b vector로 cloning 하면서 약 4.2 KDa으로
크기가 줄어..
: target 단백질만 크기가 얼마인가요?
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단백질정제
(대학원생)
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20.09.22 18:01
pET32a와 pET26b에 cloning을 완료한 후 start codon인 Methionine부터 읽어서 His-tag 이후 stop codon까지의 길이를 계산한것이 pET32a의 경우 23.2 KDa 이고, pET26b의 경우 4.2 KDa입니다!!
cloning한 ORF 크기를 질문했습니다.
target 단백질 ORF가 2종류인가요?
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단백질정제
(대학원생)
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20.09.22 18:22
pET32a와 pET26b vector에 cloning 한 target 단백질의 ORF 크기가 각각 23.2 KDa, 4.2 KDa입니다!!
질문이 정확하지 않는것 같습니다.
- pET26b vector로 옮겨서 cloning
: 2종류 ORF를 사용했다고 했는데 pET32a에서 pET26b로 vector를
변경했다고 나와 있는 것은 어떤 의미인가요?
- pET32a vector에서는 앞의 tag를 포함하여 약 23.2 KDa 이던 단백질이 pET26b
vector로 cloning 하면서 약 4.2 KDa으로 크기가 줄어
: 답변에 따르면 2종류의 ORF를 사용했다고 했는데 그렇다면 크기가 줄어든게
아니라 23.2kda와 4.2kda가 처음부터 있는게 아닌가요?
질문의 실험에서 뭐가 문제인지 정확이 설명해 주세요.
pET32와 같이 pET26에서 target 크기가 안나오는건지 pET26에서 4.3Kda가
안나오는 건지.
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단백질정제
(대학원생)
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20.09.22 19:03
제가 원하는 target 단백질만의 크기는 약 4.3 KDa 입니다.
이것을 pET32a vector tag의 뒷부분에 있는 MCS site에 cloning 하여 tag와 함께 발현되게 cloning 한것의 ORF 크기가 23.2 KDa 입니다.
그리고 이것이 CNBr 처리를 하는 도중에 많은 loss가 일어나서 tag가 없는 pET26b vector에서 발현을 해보자 라고 생각하여 다른 primer를 제작하여 pET26b vector에 새롭게 cloning하였고, 이것의 ORF 크기가 4.3 KDa입니다.
현재 문제점은 pET32a의 tag 뒷부분에 cloning 하여 발현할때는 잘 발현되던 target 단백질이 pET26b에서 순수하게 target 단백질만을 발현하고자 하였을때 발현이 되지 않는 것입니다.
pET26에서도 signal이 붙어 있고 뒤에 His가 붙어 있기 때문에 4.3kda보다는 약간
크기가 증가할수 있습니다.
현재 marker의 제일 아래 분자량이 얼마인가요?
발현되어도 확인을 못하고 있는 경우 또는 sup.으로 단백질이 분비된경우
모두 가능성이 있습니다.
현재 4.3k 발현 후 확인한 SDS-PAGE 사진 있나요?
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단백질정제
(대학원생)
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20.09.23 11:50
SPEED님 계속 신경써주셔서 감사합니다.
현재까지 했던 실험의 gene map과 SDS PAGE 사진을 첨부합니다..
조금 길 수도 있지만 꼭 부탁드릴게요.. 감사합니다ㅠㅜㅜ
작은 분자량 단백질이 큰 단백질 보다는 발현 효율이 낮아지는 것은 일반적인
현상입니다.
작은 단백질은 fusion 형태로 발현해서 발현양을 늘리는 예도 많습니다.
1. 크기가 작아서 fusion 형태로 발현하는 것이 좋을 듯 보입니다.
2. 또한 배양액과 periplasmic space도 한번 확인해 보세요.
3. 아니면 작은 단백질의 경우 유도 promoter로 순간 발현시키는 것 보다
구성 promoter로 천천히 긴 시간 발현 시키는 것이 좋을 수도 있습니다.
유도 promoter는 많이 있지만 구성 promoter는 많이 없기 때문에 1개 만들어
놓으면 향후 실험에 편리할 겁니다.
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단백질정제
(대학원생)
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20.09.23 12:59
답변 감사드립니다.
그러면 CNBr의 loss를 감수하더라도 pET32a vector에서 발현하거나, 새로운 구성 promoter를 새로 합성하는쪽으로 실험 진행해보겠습니다.
혹시 괜찮으시다면 구성 promoter와 유도 promoter의 차이가 무엇인지 알 수 있을까요?
배지에 유도물질을 넣고(예 : IPTG 등) 배양하는 것이 유도 promoter의 발현
방식이고 유도물질 없이 배양해도 단백질 발현이 되는 promoter가
구성 promoter입니다.
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단백질정제
(대학원생)
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20.09.23 14:48
정말 감사합니다!! 실험에 참고해보겠습니다.