[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 sale 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
검색광고안내
눈으로 보는 1분 과학
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
조회 357  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 cloning이 완료된 단백질이 정제가 되지 않고 있는데, 그 이유가 궁금합니다.
알단백질정제(대학원생)  | 09.22 17:04

안녕하세요! 2020년 1학기에 대학원에 입학한 뉴비대학원생입니다!

다름이아니라 1월부터 현재까지 제가 원하는 단백질을 pET32a에 cloning 하여 발현과 정제를 진행하였는데, 원하는 크기로 잘 발현이 되었고 FPLC를 통해 잘 정제 했습니다.

그러나 이것을 CNBr로 처리하던 중 원인 모를 loss가 많이 발생되어 pET26b vector로 옮겨서 cloning을 진행하였고, cloning 제대로 된것을 확인하여 발현을 진행하였는데, pET32a vector에서는 앞의 tag를 포함하여 약 23.2 KDa 이던 단백질이 pET26b vector로 cloning 하면서 약 4.2 KDa으로 크기가 줄어 단백질의 발현이 잘 확인되지 않습니다.

또한 His-tag를 사용한 FPLC 정제에서도 pick가 상승하는것이 보이지 않는데, 이것이 잘 발현이 되었는지 확인할 방법이 있을까요...?? ㅜㅜ

(지금까지 western blot, 16% SDS PAGE, FPLC pick의 상승여부로 판단해 보았는데 결과가 잘 나오지 않고 있습니다.... 고수님들 도와주세요ㅠㅠ)

#단백질
 
#발현
 
#정제
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.22 17:22  

- 23.2 KDa 이던 단백질이 pET26b vector로 cloning 하면서 약 4.2 KDa으로

크기가 줄어..

: target 단백질만 크기가 얼마인가요? 

알단백질정제  |  09.22 18:01  

pET32a와 pET26b에 cloning을 완료한 후 start codon인 Methionine부터 읽어서 His-tag 이후 stop codon까지의 길이를 계산한것이 pET32a의 경우 23.2 KDa 이고, pET26b의 경우 4.2 KDa입니다!!

대왕개구리SPEED  |  09.22 18:11  

cloning한 ORF 크기를 질문했습니다.

target 단백질 ORF가 2종류인가요?

 

알단백질정제  |  09.22 18:22  

pET32a와 pET26b vector에 cloning 한 target 단백질의 ORF 크기가 각각 23.2 KDa, 4.2 KDa입니다!!

대왕개구리SPEED  |  09.22 18:42  

질문이 정확하지 않는것 같습니다.

- pET26b vector로 옮겨서 cloning

: 2종류 ORF를 사용했다고 했는데 pET32a에서 pET26b로 vector를

변경했다고 나와 있는 것은 어떤 의미인가요?

- pET32a vector에서는 앞의 tag를 포함하여 약 23.2 KDa 이던 단백질이 pET26b

vector로 cloning 하면서 약 4.2 KDa으로 크기가 줄어 

: 답변에 따르면 2종류의 ORF를 사용했다고 했는데 그렇다면 크기가 줄어든게

아니라 23.2kda와 4.2kda가 처음부터 있는게 아닌가요?

질문의 실험에서 뭐가 문제인지 정확이 설명해 주세요.

pET32와 같이 pET26에서 target 크기가 안나오는건지 pET26에서 4.3Kda가

안나오는 건지.

알단백질정제  |  09.22 19:03  

제가 원하는 target 단백질만의 크기는 약 4.3 KDa 입니다.

이것을 pET32a vector tag의 뒷부분에 있는 MCS site에 cloning 하여 tag와 함께 발현되게 cloning 한것의 ORF 크기가 23.2 KDa 입니다.

그리고 이것이 CNBr 처리를 하는 도중에 많은 loss가 일어나서 tag가 없는 pET26b vector에서 발현을 해보자 라고 생각하여 다른 primer를 제작하여 pET26b vector에 새롭게 cloning하였고, 이것의 ORF 크기가 4.3 KDa입니다.

 

현재 문제점은 pET32a의 tag 뒷부분에 cloning 하여 발현할때는 잘 발현되던 target 단백질이 pET26b에서 순수하게 target 단백질만을 발현하고자 하였을때 발현이 되지 않는 것입니다.

대왕개구리SPEED  |  09.22 19:21  

pET26에서도 signal이 붙어 있고 뒤에 His가 붙어 있기 때문에 4.3kda보다는 약간

크기가 증가할수 있습니다.

현재 marker의 제일 아래 분자량이 얼마인가요?

발현되어도 확인을 못하고 있는 경우 또는 sup.으로 단백질이 분비된경우

모두 가능성이 있습니다.

현재 4.3k 발현 후 확인한 SDS-PAGE 사진 있나요?

알단백질정제  |  09.23 11:50  
첨부파일 파일첨부: 질문용 파일.hwp (777 KB)

SPEED님 계속 신경써주셔서 감사합니다.

 

현재까지 했던 실험의 gene map과 SDS PAGE 사진을 첨부합니다..

조금 길 수도 있지만 꼭 부탁드릴게요.. 감사합니다ㅠㅜㅜ

대왕개구리SPEED  |  09.23 12:19  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

작은 분자량 단백질이 큰 단백질 보다는 발현 효율이 낮아지는 것은 일반적인

현상입니다.

작은 단백질은 fusion 형태로 발현해서 발현양을 늘리는 예도 많습니다.

1. 크기가 작아서 fusion 형태로 발현하는 것이 좋을 듯 보입니다.

2. 또한 배양액과 periplasmic space도 한번 확인해 보세요.

3. 아니면 작은 단백질의 경우 유도 promoter로 순간 발현시키는 것 보다

구성 promoter로 천천히 긴 시간 발현 시키는 것이 좋을 수도 있습니다.

유도 promoter는 많이 있지만 구성 promoter는 많이 없기 때문에 1개 만들어

놓으면 향후 실험에 편리할 겁니다.

 

 

알단백질정제  |  09.23 12:59  

답변 감사드립니다.

그러면 CNBr의 loss를 감수하더라도 pET32a vector에서 발현하거나, 새로운 구성 promoter를 새로 합성하는쪽으로 실험 진행해보겠습니다.

 

혹시 괜찮으시다면 구성 promoter와 유도 promoter의 차이가 무엇인지 알 수 있을까요?

대왕개구리SPEED  |  09.23 14:18  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

배지에 유도물질을 넣고(예 : IPTG 등)  배양하는 것이 유도 promoter의 발현

방식이고 유도물질 없이 배양해도 단백질 발현이 되는 promoter가

구성 promoter입니다.

알단백질정제  |  09.23 14:48  

정말 감사합니다!! 실험에 참고해보겠습니다.

답변하기
할인행사 광고 검색광고
바이오닉스 바이오닉스
2020년 바이오닉스는 TECAN의 공식 파트너로 런칭! (런칭 프로모션 진행중) (1.24까지)
케이비티 케이비티
[케이비티]Heating Block, Thermo Shaker, Shaking Incubator, Stirr.. (11.26까지)
코람바이오텍 코람바이오텍
[Proteintech] 2020 마지막 전품목 이벤트! (12.28까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
무료 샘플 DNA/RNA Purification / nanostring Array / Denovix Quan.. (11.5까지)
코람바이오텍 코람바이오텍
[Cell Signaling Technology] 3+1 할인 행사! (12.31까지)
뷰키코리아 뷰키코리아
신제품 출시 기념! 최신형 병렬 증발 농축기 구매 시 정품 칠러 무상증정 이벤트! (12.31까지)
하나과학 하나과학
Socorex 2020 BIG SALE event - Socorex Acura manual micropipe.. (1.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 하반기 프로모션 행사 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (12.31까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
TECAN 한국대리점 20주년 기념 Microplate Reader & Washer 할인이 쏟아진다! (12.31까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
sale
5/6  좌우
739,000702,100
139,000132,100
238,70071,700
230,000
50,00015,000
201,30060,400
379,000
47,20044,900
388,500116,600
242,40072,800
246,60074,000
793,400753,800
924,000
22,7006,900
309,000
555,000
158,40047,600
143,800136,700
887,200266,200
136,000129,200
80,40024,200
136,000
245,20073,600
79,50075,600
최근등록   더보기 >
안녕하세요, Cell contamination 관련 질문드립니다.   10.28
Anoikis 개념에 대해 헷갈리는 부분이 있습니다   10.28
plasmid mini prep solution을 준비하려고 합니다   10.28
CEX에서 버퍼를 pH7을 사용하는 이유가 뭔가요?   10.28
학부생의 제한효소 관련 실험   10.28
B16F10 cell   10.28
박테리아 계수할때 혈구계산판   10.28
cell counting 질문입니다.   10.28
플라스미드의 제한 효소 처리 후 PCR   10.28
살균소독력실험법에서 쓰이는 중화제 제조법말고 다른 중화제 제조법을 설명해주세요!   10.27
일루미나
실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
이제욱 연재중생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고