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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 colony pcr한번만 도와주세요 ㅠㅠ
알Dani82(대학생)  | 09.22 03:14
첨부파일 파일첨부: 20200921_183512.jpg (1.66 MB)
이미지 첨부파일
Ligation 후 colony pcr을 하고 확인해보면 자꾸 사진속과 같이 밴드가 2개 뜹니다... 600bp가 나타나여 정상이구요 ㅠㅠㅠ
프라이머 짠거는 문제가 없는거 같은데 왜저러는걸까요?? 프라이머부터 다시해봐야할까요?
도와주세요😂
#pcr
 
#colony
 
#dna
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.22 09:20  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

PCR band가 흐리게 나왔지만 결과는 나온것 같습니다.

2개만 plasmid prep.해서 효소로 잘라보세요.

 

대왕개구리안재진  |  09.22 14:46  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

ligation 후 colony PCR primer를 어떻게 이용하시나요?

insert primer만 이용해서 PCR을 진행하는지

혹은 vector의 한부분 insert의 한부분으로 PCR을 진행하시는지요?

ligation 할때 insert가 과량으로 들어가고 colony PCR을 진행하면 과량의 isnert때문에 모든 colony가 양성으로 나오기도 합니다.

알Dani82  |  09.22 17:25  

speed님, 겔을 반 덜내렸을 때는 타겟하는 밴드가 보이는데 조금 더 내렸을 때는 오히려 타겟밴드가 안보이고 사라집니다.

아래의 사진이 겔을 더 내렸을 때의 사진입니다...ㅠㅠ

upload_image

알Dani82  |  09.22 17:33  

안재진님,

insert primer로 이용하고 있습니다.

궁금한 부분이 insert를 과량으로 넣었다해도 ligation된 plasmid만 균 안에 들어가는게 아닌가요...?

insert 7, 10x buffer 1, vector 1, ligase 1로 ligation을 했습니다.

 vector self ligation을 보기위해 insert넣지 않고 ligation을 진행했을 때, transformation후 콜로니가 적게 뜨는 것을 확인했습니다. 그러면

이렇게 비교해보았을 때는 insert가 잘 들어간 것으로 판단하였습니다. 혹시 제생각이 잘못된 걸까요..?

 

도와주세요 ㅠㅠㅠ

 

 

대왕개구리SPEED  |  09.22 17:35  

조금더 내리면 흐리게 보이는건 당연한 결과입니다.

600bp 정도로 보이니까 2개만 colony 배양해서 prep.  후 제한효소로

잘라보세요.

맨 아래 band는 남아있는 primer입니다.

jyun  |  09.25 01:28   

네가티브 PCR안하셨나요??

보통 PCR 하실때 네가티브와 파지티브 같이 진행해서 PCR의 성공여부를 판단하셔야 합니다.

웰 밑의 밴드는 gDNA인 듯 합니다. 저정도의 진하기를 보면 colony를 너무 많이 넣으신 듯합니다.  PCR 실패의 원인이 되기도 합니다. colony 조절이 어려우면 DW에 (뿌옇지 않을 정도로)살짝 풀어서 1ul만 넣어 보세요.

600bp부분에 target 밴드가 희미하게 보이긴 하나,,, 쭉 끌리는 것으로 보니

PCR 조건 부터 다시 잡으셔야 할 것같습니다.

anealing temp.와 time 조금씩 조정해보세요. cycle 수를 너무 높히는 것은 추천하지 않습니다. pcr error의 가능성이 있습니다.

100bp이하의 band 처럼 보이는 것은 primer dimer 일 가망성이 높습니다.

올챙이구상  |  09.26 19:40  

우선 positive band는 나오는 것이 맞습니다. 

아래 100 이하에 보이는 것은 궁금하시면 gel puri 해서 TOPO-vector에 넣고 sanger 보내서 읽어보세요.

하지만 conoly PCR 목적이 단순히 cloning 성공 여부를 빠르게 확인차 해보는 경우가 많기 때문에 저 같은 경우에는 중요하게 생각하지 않고 넘어갑니다.

위에 다른 선생님 말씀대로 primer만 넣은 것 / colony만 넣은 것 / positive (plasmid mini prep해서 확인한 것) 등의 control을 꼭 넣어보시고요. 

제 경험상으로는 저런 밴드는 primer만 넣어도 생깁니다.

저는 개인적으로 primer dimer라고 생각합니다.

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