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질문 pCMV6-entry vector - stable cell line 만들때 문제요
알땅콩(과기인)  | 09.21 11:11

안녕하세요 

현재 pCMV6 entry vector에 특정 유전자 삽입후(이건 클로닝된것 구매함) 

그 plasmid 를 넣어 cell line을 만들려고 하는데요 

 

Fugene HD를 이용해서 breast cancer cell에 transfection 한 후

72h-96h 사이에 harvest 하니 웨스턴상으로 overexpression 된것을 확인했어요 

그래서 stable cell 만들려고 G418로 selection을 했는데요 

분명 G418에 죽는 세포가 많고 안정화될때까지 한달 정도 

계속 G418 넣어주면서 subculture 했고 

안정화됐다 싶어 다시 한번 harvest 해서 웨스턴을 해보면 

overexpression 돼서 보이던 밴드가 하나도 나타나지 않아요 ㅠ 

 

3번 정도 재 실험했는데 계속 같은 반복이네요 ㅠㅠㅠㅠ

6개월 시간날리니 이젠 너무 눈치보여서;;;;; 

 

세포자체에 그 유전자 발현이 거의 없는데, 

그래서 그런걸까요? 

아니면 제가 빠트린게 있을까요???? 

 

전에 있던 실험실에서는 너무 쉽게 잘됏는데 ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ 

(물론 다른 유전자였습니다)

 

고수님들 좀 가르쳐주세요 ㅠ

 

 

#stable cell
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리bio  |  09.21 21:12  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

세포 자체에 expression이 없는데 과발현시키면 종종 그런 문제가 생길 수 있습니다. 일단 transient하게 expression이 되는 것을 확인 했다면 inducible system으로 가는 것이 어떨까 싶습니다. 

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