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 전체 > Cell Biology > Differentiation/Proliferation
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질문 3T3-L1 미분화군과 분화군에서 PCR 발현 차이가 별로 없어요
알ㅠ.ㅠ!!(대학원생)  | 09.21 09:06
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (958 KB)
이미지 첨부파일

 

안녕하세요

3T3-L1으로 지방 분화 실험을 하는 학생입니다. 

Bric 선생님들의 도움으로 3T3-L1 분화 하는거까지는 성공을 했는데요, 

세포 harvest후 PCR로 측정했을때 MDI 처리 안한 정상군과 MDI만 처리한 군에서의 유전자 발현 차이가 크지 않아요 

논문들 보면 MDI 처리 안했을 때 대부분의 유전자들이 발현하지 않던데 

제껀 왜 차이가 별로 안날까요? 

지방분화는 눈에 띄게 차이가 나고, MDI 처리 안했을 때는 지방이 거의 없습니다. 

측정한 gene은 PPAR-r, FAS, LPL, CPT-1이고, PPAR-r에서도 MDI군을 1로 봤을때 미분화군이 0.4-5 정도로 발현이 됩니다. 

FAS나 LPL은 미분화군에서 0.6-7정도로 발현이 많이되구요 

심지어 CPT-1에서는 미분화군이 아주아주 높게 나옵니다 (10배 이상) 

근데도 이렇다면 primer를 다시짜서 해보는게 제일 빠른 방법일까요? ㅠㅠ

PCR은 qPCR 장비 이용해서 사용하고있고 SYBR green 형광 이용해서 측정합니다. 

Melting curve로 확인했을때 dimer도 없었고, 곡선도 일정했습니다. 

Bio-rad에 primer 검토도 받아서 진행한거예요..ㅠㅠ

왜이러는걸까요? 도와주세요ㅠㅠ

혹시 몰라서 지방 분화된 사진 같이 첨부합니다. 

#3T3-L1
 
#differentiation
 
#PCR
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.21 09:37  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

primer 바꾸지 않아도 될것 같고 미분화 cell을 염색한 번 해보세요.

알ㅠ.ㅠ!!  |  09.21 09:53  

Speed 님, 답변 감사합니다. 

그럼 미분화 시 지방이 생겨서 저렇게 나오는걸까요?? 

진짜 분화 배지 처리하고 안하고는 눈으로 plate만 봐도 티가 나거든요....분화시킨 군들은 지방이 생긴게 눈으로 보일정도로 plate 바닥에 티가 납니다 ㅠㅠ근데 PCR로 실험했을때 저정도 차이밖에 안나타나는게 너무 이해가 안가서요...

시료 처리했을때도 저정도 차이가 나도록 감소합니다. 지방 분화시키고 시료 처리했을때는 분화군하고 육안으로 차이가 거의 안나는데도요 ㅠㅠ 

미분화군에서 약간의 지방만 있더라도 지방분화가 눈에 띄게 된 군하고 원래 20-30% 정도만 차이가 나나요??

그리고 CPT-1은 미분화시에 더 발현이 많이되는게 맞나요?? ㅠㅠ

항상 도와주셔서 감사합니다 ㅠㅠ!!

대왕개구리SPEED  |  09.21 09:59  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. CTP-1은 분화 억제시 증가합니다.

2. 분화가 조금되고 많이 되고의 유전자 차이는 눈에 보이는 oil의 차이보다

많이 나지 않습니다.

미분화 cell에 문제가 있지 않을까 생각이듭니다 

알ㅠ.ㅠ!!  |  09.21 11:28  

Speed 님, 답변 감사합니다. 

CPT-1이 분화 억제시 발현이 많이된다는건 분화를 유도하지 않았을 시에도 발현이 많이된다고 이해해도 무방할까요? 

ATCC에서 받자마자 불려서 분화 시켰는데도 이런 문제가 있다니 ㅠㅠ슬프네요 

혹시, Staining 진행 했을 때 미분화군에서 지방함량이 거의 없다면 세포 문제 말고 또 어떤 다른 문제가 있을 수 있을까요?? 

대왕개구리SPEED  |  09.21 12:06  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

미분화, 분화 cell의 sampling 시간은 어떻게 되나요?

알ㅠ.ㅠ!!  |  09.21 12:49  

6 well plate에 2x10^5 cell/well로 Seeding (금요일)하고 3일 후 confluence 확인되면 월, 수 금요일에 각각 배지 교체 합니다 

Day -3: Seeding

Day 0: 10% FBS in DMEM + IBMX 0.5mM, Dexa 1uM, Insulin 10ug/mL + Sample 

Day 2: 10% FBS in DMEM + Insulin 10ug/mL + Sample 

Day 4: 10% FBS in DMEM + Sample 

Day 8에 harvest 

미분화군에는 동일한 날에 10% Bovine Serum in DMEM 배지로 교체해줍니다. 

대왕개구리SPEED  |  09.21 13:03  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

target 들이 얼마나 변동되는지 우선 미분화 cell만 0, 2, 5, 8day 확인이 필요할

듯 보입니다만..

또한 WBT로 확인하면 차이가 확실하게 날수도 있습니다.

mRNA는 cell내에 항상 많은 양을 가지고 있지 않습니다.

따라서 미분화 cell에 문제가 없는지 확인 후 mRNA, protein 순으로 확인해

보는 걸 추천 합니다.

 

알ㅠ.ㅠ!!  |  09.21 16:51  

넵 조언 감사드립니다~!

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