[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 sale 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
검색광고안내
눈으로 보는 1분 과학
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
조회 371  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 안녕하세요 Cloning 초보입니다.. 혼자 공부해보다가 도저히 모르겠어서 질문 남깁니다..
알duddhr(대학생)  | 09.18 13:47

안녕하세요? 

cloning construct를 만들어야해서 혼자 공부중인 학생입니다.

그래서 이전에 선배님들께서 만들어놓았던 construct를 혼자 보면서 감을 잡아가고있는데 이해가 안가는것들이 있어서 여쭤봅니다.

1) GFP

벡터에 한 유전자가 들어있는 Construct가 있고(제가 만든것이 아닙니다) 교수님께서 GFP를 보고싶으시다 하셔서 GFP를 달고자 하는데 그 유전자 중간에 GFP Sequence를 넣는것인가요? 그렇게 되면 유전자의 sequence가 달라지지는 않나요....? 또 codon으로 번역하면 서열이 바뀌게 되니까 codon도 바뀌게 되는데 이걸 gfp sequence를 넣어줄때 맞춰주는건가요...? 

 

2) promoter

promoter를 보면 보통 insert dna 바로 앞에 있는것이 아닌 몇 뉴클레오타이드 앞에 떨어져있는데 이것은 왜 그런것인가요? 또한 얼마나 떨어뜨려야한다는 기준이 있나요,,,?

 

3)tag

Tag도 마찬가지로 유전자 바로 뒤에 붙어있는 것이 아닌 몇 nt 떨어져서 붙어져있던데 이것도 이유가 있나요..? 또한 promoter에서 질문드린것과 마찬가지로 기준이 있나요..? 그리고 기존에 있던 dna의 끝이 stop codon으로 끝나는데 tag을 붙여주려면 유전자의 stop codon을 지워주고 몇 nt 떨어뜨린 다음에 제가 원하는 tag sequence 붙여주고 바로 종결코돈을 넣어 주면 되는것인가요,,,?

진짜 너무 기초적인 질문인데 제가 하나도 몰라서 찾아보다가 도저히 안되겠어서 질문드립니다...죄송합니다ㅠㅠㅠㅠ 진짜 cloning은 처음이라서 혹시 저같은 사람에게 추천하실 논문이나 책있으면 열심히 공부하겠습니다.. 

#cloning
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
dd  |  09.18 15:50   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. GFP tagging vector를 쓰려면 보통 target protein의 N-terminal이나 C-terminal에 오도록 cloning을 하죠. 문제는 여기에 GFP 서열이 붙으면서 기존 target protein에 영향을 줄 수도 있다는 건 감안해야 합니다. 또한 codon 맞춰서 넣어줘야 frame-shift 안 일어납니다.

2. RNA polymerase가 결합하고 작동하기 위해서는 어느 정도 떨어져 있어야 제대로 작동할 수 있기 때문 아닐까요? 일반적으로 사용하는 과발현 vector들의 경우, target gene sequence를 쉽게 넣을 수 있도록 MCS를 만들어 둡니다. 거기 잘라서 넣으시면 promoter가 제대로 작동할 지 걱정 안 하셔도 될 겁니다.

3. 1번과 조금 이어지는 내용인데 N-terminal이나 C-terminal에 tag를 다는 이유는 detection을 쉽게 하기 위해서입니다. 그런데 tag처럼 작은 서열을 달더라도 target protein의 구조에 영향을 줄 수도 있는 가능성을 염두해야 합니다. 그래서 linker sequence라고 하서 구조적으로 영향을 적게 주는 서열들 (glycine, serine 같은) 을 달아줘서 tagging을 하더라도 target protein에 최대한 영향을 적게 주게 합니다. 보통은 C-terminal에 많이 tagging을 하니까 TARGET-linker-tagging (or GFP) -stop이 오도록 cloning을 하면 되겠네요. stop codon은 GFP나 tagging 뒤쪽에 서열이 오도록 만들어줘야 합니다. 그래야 같이 translation 되겠죠?

알duddhr  |  09.20 12:29  

감사합니다. 정말정말 감사합니다.

개구리bio  |  09.21 20:56  

예전에는 target (no STOP codon)-GFP fusion 형식으로 GFP를 달았는데 

요즘은 P2A를 많이 사용합니다. 

https://en.wikipedia.org/wiki/2A_self-cleaving_peptides

이러면 target 과 GFP이 같은 promoter로 regulation되기 때문에 같은 protein expression을 보여주기때문에 각각을 따로 확인할수 있습니다. 

답변하기
할인행사 광고 검색광고
바이오닉스 바이오닉스
2020년 바이오닉스는 TECAN의 공식 파트너로 런칭! (런칭 프로모션 진행중) (1.24까지)
케이비티 케이비티
[케이비티]Heating Block, Thermo Shaker, Shaking Incubator, Stirr.. (11.26까지)
코람바이오텍 코람바이오텍
[Proteintech] 2020 마지막 전품목 이벤트! (12.28까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
무료 샘플 DNA/RNA Purification / nanostring Array / Denovix Quan.. (11.5까지)
코람바이오텍 코람바이오텍
[Cell Signaling Technology] 3+1 할인 행사! (12.31까지)
뷰키코리아 뷰키코리아
신제품 출시 기념! 최신형 병렬 증발 농축기 구매 시 정품 칠러 무상증정 이벤트! (12.31까지)
하나과학 하나과학
Socorex 2020 BIG SALE event - Socorex Acura manual micropipe.. (1.31까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 하반기 프로모션 행사 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (12.31까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
TECAN 한국대리점 20주년 기념 Microplate Reader & Washer 할인이 쏟아진다! (12.31까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
sale
2/6  좌우
887,200266,200
309,000
246,60074,000
555,000
230,000
80,40024,200
739,000702,100
388,500116,600
139,000132,100
238,70071,700
793,400753,800
379,000
158,40047,600
47,20044,900
242,40072,800
143,800136,700
79,50075,600
136,000129,200
245,20073,600
50,00015,000
201,30060,400
136,000
924,000
22,7006,900
최근등록   더보기 >
플라스미드의 제한 효소 처리 후 PCR   10.28
살균소독력실험법에서 쓰이는 중화제 제조법말고 다른 중화제 제조법을 설명해주세요!   10.27
Real time PCR 시 standard curve   10.27
리포좀에 ni(2-nitroimidazole) 다는방법알려주세요!   10.27
SDS running buffer 조성 질문입니다.   10.27
Molecular sieve   10.27
2.4kb DNA PCR 조건질문드려요 !!   10.27
cell contamination 되었는지 확인   10.27
디스크 확산법의 배지 관련하여 질문드립니다!!   10.27
실험동물 눈가 상처(털 빠짐)에 관한 고견을 구합니다.   10.27
Terumo bct
실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
이제욱 연재중생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고