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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 cloning 후 웨스턴 band size
알ㄱㄴㄷ(과기인)  | 09.17 12:42
안녕하세요 cloning 관련하여 지식이 짧아 도저히 이유를 모르겠어서 질문드립니다.

대략 플라스미드 구조는 cmv promter뒤에c1c2domain+target입니다. target앞에 c1c2도메인이 추가된 plasmid입니다. target단백질의 크기는 55kda이고 c1c2 domain은 대락 30kda 정도의 크기여서 80kda가 넘는 위치에서 웨스턴밴드가 나올것으로 예상하였으나 원래 taget의 사이즈인 55kda에서 밴드가 관찰됩니다

웨스턴은 sds gel이용하여 평범하게진행하였고 sample buffer 에 dtt를 추가하여 boiling 하였습니다 클로닝이 문제일까요 아님 발생가능성이 있는경우인가요?
#cloning
 
#c1c2
 
#protein size
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  09.17 12:48  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

empty vector와 target+vector의 SDS-PAGE 결과는 어떻나요?

알ㄱㄴㄷ  |  09.17 12:59  
control로 사용한 empty vector에서는 55kda 위치에 밴드가 나오지않아 처음에 c1c2도메인의 존재를 미처 생각 못하고 당연히 타겟밴드일 것으로생각했습니다

target+vector는 실험에 사용하지않아 현재 293t세포에 트랜스팩션중이며 3개를 다시 비교해보려고 계획하고 있습니다. 다시 실험 하기전 여러가능성을 생각해보려하는데 지식이 짧다보니 예상이 쉽지않습니다.

교수님도 현재 결과도 맞는 밴드일수있지만 레퍼런스를 같이 한번찾아보자고하셔서 여러 가능성을 탐색중입니다
대왕개구리SPEED  |  09.17 13:03  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

SDS-PAGE에서 80K 이상에서 발현 단백질이 보이는지 물어본 겁니다.

알ㄱㄴㄷ  |  09.17 13:17  
아니요 보이지 않습니다 55kd위로는 밴드가보이지 않습니다
대왕개구리SPEED  |  09.17 13:22  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

80K이상이 정상 발현 된었다면 양이 적어도 보일텐데 이상하네요?

55K가 보인다면 어떤 이유에서 55K가 발현된걸로 봐야 할겁니다.

알ㄱㄴㄷ  |  09.17 13:28  
네ㅜ 희미하게라도 보인다면 거기이겠거니 하겠는데 너무나정확히 그 위치에 있어서요 ip로 확인해보고 그래도 그 위치에 밴드가 나온다면 그위치에 발현되는것으로 생각하고 원인을찾아야할거 같습니다 제교수님도 비슷하게 답해주셨습니다 어떤이유인지는 잘모르겠지만 55kd에 발현하는게 맞는거같다 하지만 이유를찾아보고 ip와 다른 플라스미드로도 확인해보자였습니다 조금더 공부를 해봐야겠네요 감사합니다!
대왕개구리SPEED  |  09.17 13:50  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

target에 ATG가 붙어 있나요?

C1C2가 만들어 지고 떨어져 나간 경우보다 처음 부터 안만들어 졌을

가능성이 높아 보입니다.

transcription level에서

1. C1C2 N-term,

2. C1C2 C-term

3. C1C2 C-term + target N-term

4. target

위 4개를 RT-PCR 해 보면 알수 있을 겁니다.

 

 

 

대왕개구리강시  |  09.17 15:54  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

제가 다루는 세균에는 120kDa 짜리 단백질이 만들어집니다.

건강하게 자라는 동안은 SDS-PAGE로 전체 단백을 걸어보면 120kDa 이 보이고 웨스턴으로도 확인이 됩니다.

하지만 세균의 상태가 조금만 거시기하면 degradation되서 작은 밴드 세개로 나눠집니다.

pGEX 벡터의 GST 유전자에 어떤 목적 단백질 A 유전자를 퓨전시켜서 발현시키면 항상 GST-A 재조합 단백과 GST 단백이 같이 나옵니다.

이는 GST-A 단백이 늘 잘려서 GST-A, GST, A 이렇게 세가지 단백이 만들어진다는 거죠. 이처럼 어떤 단백이냐에 따라서 퓨전된 단백이 degradation 되는 일은 종종 볼 수 있는 현상입니다.

 

님의 경우도 C-terminal에 퓨전시킨 단백질이 홀로 발현된 것이 C1C2 퓨전 단백이 만들어진 후 degradation된 것으로 추측할 수 있습니다.

반드시 C1C2 퓨전이 필요한 경우라면 목적 단백질을 N-terminal에 위치하도록 클로닝 해보세요.

알ㄱㄴㄷ  |  09.18 03:30  

 RT-PCR로 확인 해보아야 겠습니다. 그리고 제 실험에서 C1C2 도메인이 반드시 필요하진 않기때문에 단백질이 맞게 잘 발현된것인지 IP로 확인해보고 사용해야겠네요. 분해될 가능성이 없지 않다는 것도 위안이 됩니다. 답변 감사합니다.

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