실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
Western blot 로딩 정량 질문입니다 ...
레벨1 D&D (대학원생)
먼저 저희 실험실 western blot 프로토콜을 말씀드리면
단백질 분리할때 lysis buffer는 RIPA buffer로 100x protease, phosphatase inhibitor 첨가 후 사용합니다.
단백질 분리 후 단백질을 BCA 법으로 정량해서
단백질 정량한 값 (보통 3~5 ug) - X ul
BIX RXX 사 4x Lami XXXX buffer (B-mercaptoethanol 포함) - 5 ul
BIX RXX 사 2x Lami XXXX buffer (B-mercaptoethanol 포함) - 14-X ul
DTT - 1 ul
이 비율로 60 ul 나 100 ul로 만들고 95도 10분 boiling 후 식혀서
-20도 보관 했다가 로딩하기 전에 95도 5분 boiling 후 식혀서 탭핑하고
한 10000정도 되는 빠른 속도로 centrifuge 10~20초 정도 돌린 뒤
tube 천장에 묻은 물방울 다시 내려주고 로딩을 하는데
보고자 하는 단백질 A가 인산화 된 정도를 비교하기 위해
단백질 A를 동일하게 로딩해주려고 하는데 단백질 정량했을때
이 단백질A가 정량이 되지 않기 때문에 추가적으로 눈대중으로 보고
로딩을 계속 다시 해줍니다.
그런데 이때 분명 특정 샘플을 같은양을 로딩을 해줬는데
다음번에 로딩해서 확인하면 그 양이 또 다른경우가 있습니다.
BCA 정량값을 봤을때는 파이펫 에러는 아닌거같은데
제 손에 그냥 문제가 있는건지 아니면 프로토콜에 문제가 있는건지
단백질 양이 너무 적어서 그런건지 혼란스럽습니다.
로딩할때는 20p 파이펫으로 화이트팁 끼워서 끝에서 살짝 따준다음
전기영동 버퍼 부어져있는 젤에 넣는데 이때 살짝 다른쪽 영동버퍼에 팁을 잠깐 담궈서 (?) 팁끝에 자잘하게 묻어있는 로딩 mixture를 떼는데
이때 에러가 생기는건지 ...
정량이 되지 않는 단백질의 인산화 변화를 해보시거나
적은양의 단백질을 로딩한 경험이 있는분이 있으시다면
답변좀 달아주시면 감사하겠습니다 ...
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