1. 정제하고자 하는 물질이 + 또는 - charge가 있나요?
저분자라면 desalting하기 힘듭니다.
pH elution하면 salt를 사용하지 않아도 됩니다.
2. 유도체화 후 다시 free상태로 돌리기 힘듭니다.
IEX 정제 시는 어떤 방법으로 detection 했나요?
유도체 외에 다른 방법으로 detection하는 것이 좋을 듯 합니다.
정제하고자 하는 물질의 분자량이 얼마인가요?
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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20.09.06 19:48
빠른 답변 감사드립니다.
1) 네 amine group(+, positive charge)가 존재합니다.
HCl으로 elution 시 약 4-6N 농도에서 elution이 됩니다. 이때 eluent를 중화시키기 위해서 NaOH로 pH를 적정했습니다. (acidic 상태에서 dry freezing이나 evaporation시 기기 부식에 영향이 있다고 알고 있습니다.)
이때 생성되는 NaCl(중성염)때문에 동결건조시 salt가 다량 석출?되어 적은 volume으로 resolution에 어려움이 있었습니다.
제가 잘못 알고 있는게 있을까요?
아 그래서 cation - anion 순서로 교차해서 사용하면 해결될 수 있을까요?
2) 아 그렇군요. 유도체화는 dansyl chloride로 진행했습니다. 따라서 amine group에 dansyl group이 binding 해서 특정 파장에서 TLC나 HPLC로 확인했었습니다.
아직 공부를 많이 못했는데 Fmoc로 derivatization 후 piperidine으로 제거 가능할까요? 고체상에서 amino acid 합성시 쓰이는 시약으로 알고있습니다. amine 계열 물질을 Fmoc로 derivatization 후 검출하는 논문을 보았습니다.
일단 유도체화 없이 다른 파장에서 진행해보겠습니다.
감사합니다.
IEX를 상당히 높은 몰농도의 HCl로 elution한다구요?
IEX 실험시 pH로 elution할 경우 20mM 정도 사용합니다.
현재 물질이 IEX가 가능하다면 AEX는 힘들고 CEX만 가능합니다.
또한 현재 CEX가 정상적으로 되는지 확인이 필요합니다.
저분자 물질인데 resin과 동일한 평형화는 어떻게 하나요?
저분자 compound는 silica 또는 C18로 정제하는것이 쉽습니다.
우선 detection 방법을 정해야 할것 같습니다.
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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20.09.06 20:17
빠른 답변 감사합니다.
네! polyamine 계열 물질입니다. 그래서 유사 논문을 찾아보았을때 고농도의 HCl으로 elution하는 것을 참고해서 진행했습니다. (처음에 저농도의 salt와 HCl으로 진행시 binding은 되나 elution이 되지 않았습니다.)
CEX와 AEX는 각각 cation, anion exchange chromatography인가요?
맞다면 CEX와 AEX를 순서대로 병행하려 했습니다. salt가 제거될까요?
일단 CEX 진행시 extract sample, loading 후, wash후, 해당 HCl농도에서 elution 후로 나누어 derivatization하여 TLC로 확인 시 band의 유무로 CEX가 정상적으로 진행되었다고 판단했습니다.
resin 전처리 후 평형화는 다른 buffer를 사용하진 않았습니다. pH를 중성으로 적정 후 진행했습니다.
그렇다면 유도체화 없이 검출할 수 있는 다른 방향을 알아보겠습니다.
감사합니다.
현재 실험은 IEX라고 보기는 힘듭니다.
평형화도 전혀되지 않은 상태고 아마 resin activation 또한 정상적으로 되었는지
의문이 들구요.
AEX는 불가능합니다.
silica 정제가 편한데 굳이 고농도 산을 사용해서 실험 후 산 또한 제거를
해야 하는데 힘듭니다.
정제는 가장 편한 방법으로 하고 수율이 높은 방법으로 하는것이 원칙입니다.
현재 정제가 되는지는 어떤 방법으로 확인하나요?
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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20.09.06 20:37
빠른 답변 감사드립니다.
아 그렇군요. 전처리는 일단 resin의 data sheet를 보고 진행했었습니다. 사수가 없고 혼자 해본거라 결과만 보고 섣부르게 정상적으로 된다고 판단했나봅니다.
일단 다시 공부해서 resin의 전처리와 평형화를 진행해보겠습니다.
sillica open column 말씀이신가요? TLC 조건 참고해서 전개용매 설정 후 실험해보겠습니다.
지금 정제여부는 추출 및 IEC 단계별로 유도체화로 target 물질을 측정하고 anthrone법으로 환원당 정량하고 고추(식물)에서 추출하기에 capaicin 도 정량했었습니다. 그 밖에 단백질 및 지질은 아직진행 해보지 못했습니다.
정제에 대해 아직 부족한 부분이 많습니다 ㅠㅠ
감사합니다!
저분자 물질이고 수용액에 잘 녹으면 추출물을 제일 처음 MW cut-off하면
1차 정제가 쉽습니다.
2차 정제는 CEX resin 또는 silica column으로 정제하면 될것 같습니다.
silica column은 TLC 전개용매를 바탕으로 극성을 정해 silica column의 mobile
phase를 정하면 됩니다.
최종 정제 확인은 HPLC도 사용가능하지만 남아있는 물질 별 detection 방법이
모두 다르기 때문에 상당히 번거롭고 TLC로 전개해서 황산으로 태워보면
남아있는 물질 종류에 관계없이 대부분 검출 가능합니다.
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레벨2
소순굉
(대학원생)
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20.09.06 20:57
답변 감사드립니다. 많은 도움이 되었습니다! 좋은하루 되세요:)