- blocking만 하면 색이 나오지가 않습니다ㅠㅠ
: blocking을 하지 않으면 발색이되나요?
고정화를 어떤 방법으로 했고 사용하는 microwell은 어떤 제품인가요?
-
레벨1
화이팅!
(대학생)
-
20.09.03 21:26
안녕하세요!
먼저 답해주셔서 감사드립니다!
blocking을 했을 때는 Ag의 유무와 상관없이 색이 나옵니다
두개 다 색이 꽤 진하게 나오고 색의 강도는 크게 나지 않습니다.
고정화는 4도 냉장고에서 12시간정도 고정화를 시킨 후 PBST로 wahing을 해주었습니다.
microwell 은 cell culture용 96well plate에 진행했습니다!
고정화를 어떤 방법으로 했고 사용하는 microwell은 어떤 제품인가요
질문은 최대한 정확하고 자세히 설명을 해야 문제 해결에 도움이 됩니다.
1. blocking만 하면 색이 나오지가 않습니다
2. blocking을 했을 때는 Ag의 유무와 상관없이 색이 나옵니다
1과 2중 어느것이 맞나요?
Ag 없을 때 발색이 되면 Ab 검토가 필요합니다.
사용한 blocking 시약, Ag, 1st Ab, 2nd Ab는 어떤 종류인가요?
그리고 ELISA 용 microwell을 사용해야 합니다.
-
레벨1
화이팅!
(대학생)
-
20.09.04 03:23
앗 죄송합니다.
1번입니다. blocking을 하지 않았을 때는 Ag유무와 상관없이 색이 나온다는 말이였습니다.
이경우는 plate바닥이 blocking이 되지 않아 Ab가 바닥에 붙어서 색이 나온다고 생각하고 있습니다.
blocking은 3% skim milk와 3%BSA solution 이며 모두 PBS에 희석하였습니다.
Ag은 재조합 단백질이며 Ag, Ab 모두 특정 그룹에서 받아오는 것이라 정확한 정보는 모르겠습니다ㅠ. (혹시 제가 이부분에서 더 공부가 필요한 부분이 있다면 언급해주신다면 찾아서 공부해보도록 하겠습니다.)
이 Ag을 받을 때 cell culture plate에서 실험을 해도 괜찮다고 해서 진행을 했는데 결과 차이가 많이 날까요?? 일단 어제 구매를 하긴해서 기다리고 있는 중입니다!
또한 Ab는 비교적 안정하나 Ag은 좀 더 불안정하다고 알고있는데 보편적으로 4도 냉장고에 2~3주간 보관해도 될 지 궁금합니다. 감사합니다!
cell culture용은 바닥에 coating되어 있어 Ag가 균일하게 붙을지 의문입니다.
Ag는 2주 정도면 냉장 보관이 가능 할 것으로 보이지만 더 길어지면
aliquot 해서 냉동 보관이 좋을 수도 있습니다.
-
레벨4
chiterra
-
20.09.04 13:05
1. 우선, 항원과 항체 반응이 제대로 이뤄지고 있는지를 확인해 보시면 좋을 것 같습니다.
ELISA를 통해 확인하기 전에 Western blot등을 통해 사용하시는 항체가 항원과 결합하는지를 확인을 해야 할 것 같습니다.
항체가 항원과 결합이 되는지에 대한 확인이 되야 그 이후 단계에 의미가 있을 것 같네요.
2. "Speed"님께서 조언하신 바와 같이 ELISA용 microwell plate를 사용하시기 바랍니다. 실험 방법을 보니, 물리흡착을 이용한 고정화 방법인 것 같네요.
3. 항체가 어떤 종류인지를 모르겠지만, 특히, monoclonal antibody라면 항체 종류를 좀 더 다양하게 해서 반응성 있는 항체에 대한 스크리닝을 진행해야 할 것 같습니다.
4. ELISA에 영향을 줄 수 있는 인자에 대해 실험을 진행하시면 좋을 것 같습니다.
- 항원 고정화 방법 : 물리흡착 방법, chemical 이용하는 방법, 고정화 버퍼의 종류 (PBS (pH 7.4), carbonate buffer (pH 9.6), 고정화 온도/시간
- 블라킹용액 : 종류 (BSA, casein, polymer 등)
5. ELISA 시험법 개발시, 다음과 같이 진행해서 단시간에 조건 선정을 해보시는 것은 어떨까 합니다.
- A~H행에는 항원 농도별
- 1~12열에는 1차 항체 농도, 2차 항체 농도, blocking reagent 종류
-
레벨1
화이팅!
(대학생)
-
20.09.06 04:15
네, 친절하게 답변 주셔서 정말 감사드립니다!
차근차근 다시 실험해보도록 하겠습니다.