실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
클로닝이 계속 안되서 질문드립니다.
레벨1 타르가르옌 (대학생)
양 끝에 Sph1, Xma1 제한효소자리가 있는 insert가 150bp정도 되고 PCR은 성공적으로 된 것을 전기영동으로 확인하고 clean up을 했습니다. 그리고 각 제한효소를 unit에 맞게 넣어주고 4시간 반응으로 vector와 insert를 모두 자른 후 전기영동으로 확인하고 clean up을 해주었습니다. 그리고 ligation할 때 벡터를 5ng/ul, insert를 0.6ng/ul로 넣어주었습니다. ligation의 확인을 위해서 벡터도 ligation했습니다.(안될 테지만) insert가 작아서 계산해보니 양이 저렇게 되더군요. 그리고 반응을 4시간 상온에서 시켜고 바로 스프레딩 하고 on시키고 보니 벡터만 있는 곳에서 콜로니가 많이 떴고 insert시킨데도 물론 떴는데 insert가 되지 않았습니다.
실험에서 뭐가 잘못되었을까요...? 제한효소처리가 잘못된걸까요? 밴드확인햇을 때는 정상적으로 잘 잘림을 확인햇습니다. 아니면 ligation에서 vector가 다시 붙은 건가요? 아니면 insert가 너무 작아서 안들어가는건가요?
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