실험 Q&A Plant Biology > Transformation
Spectinomycin resistance cloning이 잘 안돼요.
레벨2 ade95a (대학생)
식물용 expression vector를 만드느라 spectinomycin resistance backbone plasmid와 다른 PCR product를 이용해 Gibson assembly를 하는 중입니다.
총 두가지 종류의 클로닝 중인데 사이즈는 각각 13700bp+700bp / 9200bp+5000bp 입니다.
Gibson용 bridge는 25bp로 잡았고 재료들은 각각 enzyme cut 후 gel elution, PCR 후 gel elution으로 준비했습니다.
Transformation은 기본적으로 backbone을 50ng 기준으로 1:3이 되도록 이용하고 있고 c.cell은 DH5a를 이용, c.cell 50ul와 gibson 50℃ 1hr를 한 총 20ul mixture를 섞어 얼음에 5m 대기, heat shock 42℃ 1m30s, 다시 얼음에 5m 대기. 그 후에 항생제 없는 LB media에 1h 37℃ shaking incubation 후 spectinomycin 100ug/ml LB plate에 spreading 합니다.
현재 여러번 시도해 보았는데 (1:3인 비율을 바꾸거나 backbone을 100ng 이용한다거나) colony를 한 번 밖에 보지 못했고 그마저도 false positive인 것으로 확인했습니다.
Spectinomycin을 이용하는 cloning을 처음해서 그런데 위 과정에서 잘못되거나 수정하면 좋을만한 procedure이 있을까요?
조언 부탁드립니다.
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