먼저 "4°C에서 30분, 그다음엔 37°C에서 45분, 그리고 37°C에서 1시간 30분을 실험" 이게 무슨 말인가요? primary antibody incubation을 말하나요?
사용한 antibody (conjugated 된 antibody인지?) 무엇인지?
fix/perm을 했는지?
이러한 내용을 알려주어야 좀 더 정확한 답변을 얻을수 있습니다.
저는 fix/perm을 하면 primary는 보통 overnight으로 반응시킵니다.
surface marker인 경우는 4oC에서 1-2시간
그리고 antibody는 antibody에 따라 다르기는 하지만 보통 1:50 으로 사용하구요. 100uL에 20uL는 1:5인데요???
flow는 굉장히 예민하지만 정확한 기계입니다.
그러기 위해서는 완벽한 control (negative/positive control)이 필요합니다.
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Arkadis
(대학생)
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20.08.24 09:55
1. 먼저 "4°C에서 30분, 그다음엔 37°C에서 45분, 그리고 37°C에서 1시간 30분을 실험" 이게 무슨 말인가요? primary antibody incubation을 말하나요?
-> 3회 실험을 했고 1회차에선 4도 30분 했는데 염색이 안 돼서 2회차엔 37도 45분, 그랬는데도 안 나와서 3회차에 37도 1시간 30분 했습니다.
2. 사용한 antibody (conjugated 된 antibody인지?) 무엇인지?
-> antibody는 conjugated antibody로, CD34-FITC, CD34-PE, CD49f-PE 총 3종류로 각각 single stain 했습니다. 근데 어느 하나 제대로 염색된 sample이 없더군요..
3. fix/perm을 했는지?
-> 제조사 protocol에 따로 언급된 것이 없고, 차후 sorting을 위해서 염색하는 거라 추가적인 처리는 하지 않았습니다.
4. 그리고 antibody는 antibody에 따라 다르기는 하지만 보통 1:50 으로 사용하구요. 100uL에 20uL는 1:5인데요???
-> 제조사는 1x106cell당 20uL 사용을 권장하여 해당 농도에 cell을 맞추어 20uL을 사용하였습니다.
제조사 protocol이나 어느 protocol을 뒤져봐도 다른게 없으니 전혀 짐작이 되지 않습니다..
CD34 staining 하는 protocol 보내드릴수 있습니다.
쪽지로 받을수 있는 이멜 주소 남겨주세요
Plot을 보여주세요
왠지 Voltage 값 조절 안하셔서 아예 peak을 관찰하지 못한 경우가 아닐까 싶습니다.
stain과 별개로, plot 상에서 peak를 확인하시기 위해서는 positive peak가 나타나게끔 기기의 voltage 값을 FACS 프로그램 (BD의 경우 FACSDiva software)를 통해 조절해주셔야 합니다. 아마 이걸 못하시고 기존에 설정되어 있는 디폴트 값이 positive peak를 나타나게 하기에 작은 값인게 문제이지 않을까 싶습니다.
정 peak가 뜨는지 안뜨는지 확인하기 가장 쉬운 방법은 셀을 쓰지 마시고, compensation bead 쓰는 방법이 있습니다. Compensation bead에는 극소량의 ab 및 voltage 값으로도 peak의 유무를 확인할 수 있기 때문입니다.
CD34 보시는 걸로 봐서 HSC 염색해서 보시는 것 같습니다. surface protein 보는 것이기 때문에 fix/perm 등의 Intracellular staining은 필요치 않습니다.
제조사에서는 보통 과량의 Ab를 사용하는 것을 recommend 합니다. 아직 기기 운용이나 Ab staining 잡혀있지 않으시기 때문에 Antibody titration 까지는 하실 필요 없고, 일부 antibody 및 ICS용 antibody를 제외하곤, 100 uL cell suspension에 1~2 uL만 사용하면 충분히 stain 할 수 있습니다. 다만 이는 cell type별로도 차이가 있기 때문에 사전에 antibody titer를 설정하셔서 최적의 조건을 찾으시길 바랍니다.
Antibody stain protocol의 경 4도 에서 30min stain 하시면 충분합니다. 대부분의 protocol에서 아마 4도 30분을 추천합니다만, antibody 별로 최적의 incubation 조건을 잡을 수 있다면 위의 titration과 더불어 최적화 하시면 되겠습니다.
사실 FACS sample 염색은 굉장히 간단한 과정입니다. wash 하고 염색하고 wash하고 찍고 혹은 ICS 진행 시 fix/perm 하고 염색하고 wash하고 찍고.
어려운 점은 그 sample들을 제작하고 FACS를 통해서 결과를 도출 함에 있어서 최적의 조건을 잡는 과정이 까다롭다는 것입니다.
아무쪼록 답변이 도움 되었기를 바라며 부족한 부분은 구글링 하시면 아주 많이 도움 될 겁니다. 또 최근 브릭에 면역학 노트로 연재되고 있는 연재물에 FACS 관련된 문서가 있는데 참고하시면 되겠습니다.
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Arkadis
(대학생)
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20.08.26 10:06
voltage 같은 경우는 operator분이 설정을 여러번 변경하면서 측정하긴 했습니다. 근데 변동폭이 너무 좁더라구요..
저도 찾아본 모든 protocol이 4도 30분 정도 혹은 4도 80분을 사용하던데 너무 반응이 적으니...
37도에서 한 것도 저 cell을 분양받은 곳에서 37도에서 진행했다고 해서 변경해 본 것입니다.
제 기억에 voltage는 496-504까지 변경하면서 했던거로 기억합니다.
면역학 노트쪽은 저도 확인해보긴 했는데 도저히 이번 문제에서 어떻게 적용할지가 애매해서...
쪽지는 보내본 적이 없는데 어떻게 보내는지 몰라서 이메일 여기에 남깁니다.
hsky9494@naver.com
FITC랑 PE를 이용한 Double staining인가요?
혹시 control을 이용하여 compensation은 제대로 잡은건가요?
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Arkadis
(대학생)
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20.08.26 10:37
위에 올린 건 antibody에 대한 성능 실험인데 cell 분양받은 곳에선 10배 이상 나왔습니다.
각 dye에 대한 single staining test 입니다.
답변을 하나 했는데, 다시 읽어보니 비슷한 테스트를 이미 하셨었네요..
30분 4도배양을 하셨으면 안되는게 이상한데요..? 세포가 맞는세포인가요..? 10배이상 나왔다는 곳에서 1uL만이라도 얻어오셔서 파지티브로 걸어보셔야 될 것 같은데요..
그냥 바로 100,000cell에 50uL 토탈 볼륨으로해서 1uL안티바디만 넣어도 시그널은 있다면 무조건 나와야 할 것입니다.
Flow는 진짜 그냥해도 안티바디를 이용한 것이기 때문에 반응성이 되게 뚜렷이 예측이 가능한데, 만약 예측한대로 나오지 않는다면, 그 세포자체의 문제이거나 안티바디의 문제이거나 둘중 하나일 것 같습니다.
지금 이 정도로 테스트 해보셨다면 아예 그 마커가 없는 세포일 가능성도 있을 것 같은데요 ;;
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Arkadis
(대학생)
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20.08.26 15:47
비교 data 필요하실듯 하여 분양받은 곳에서 보내준 data를 첨부해봅니다.
같은 cell에 같은 Ab인데 이렇게 나와야 하는데 아주 찔끔 움직이니 너무 답답하네요...
그쪽에서 세포를 실수로 다른걸로 보내줬을 가능성은 없는건가요? 만약 테크니션같은 분이 voltage조정을 같이 해주셨다면 그런 문제는 아닌 것 같고.... voltage아니고 같은 안티바디를 썼다면 이건 그냥 세포가 다른세포인 것 같은데요... stem cell은 잘 모르지만 분열된건 아니겠죠..?
이게 isotype control이 없다보니, 그 컨트롤이라고 데이터를 보내준 곳에서 온 데이터가 정말 100% CD34+인지 아니면 데이터 리딩할때 백그라운드가 저정도로 나온건지가 애매해서.. 그 세포를 보내 준 곳에서는 99%세포가 CD34+라고 생각하는 것이죠? 그럼 받아오신 세포를 어떻게 체크 해 보셔야 될 것 같습니다.. Flow는 있으면 있고 없으면 없는데, CD34같은 selection마커로 사용하는 건 정말 뚜렷이구분이 될거에요.
그림님께서 말씀하신 것처럼 분양받은 곳에서 준 plot만 봤을 때는 피크로 솟아있는 부분이 negative pop인 듯 한데요..? 오른쪽으로 끌리듯 positive 부분이 있는 것 같구요. 질문자님이 올려주신 plot에도 signal은 약하지만 비슷한 경향으로 보이기도 하구요. 그리고 10배 이상 expression 하는 것으로 보이는 것이 아닙니다. voltage 올리거나 ab 더 많이 치는 것 등으로 100배 이상으로 expression 하는 것처럼 보이게 할 수도 있습니다. 어쨌든
올려주신 plot의 순서는 아마 CD34+ FITC/PE, CD49f PE로 생각됩니다. negative pop은 오퍼레이터분께서 나눠 주셨다니 크게 문제 없을 것 같고, 여기에 질문자님 unstained sample (negative control)이 있다면 일부나마 발현하는 여부를 관찰할 수 있겠죠?
그 cell이 어떤 셀인지만 알아도 발현 여부 대충 확인할 수 있을텐데 셀이 뭔가요?
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Arkadis
(대학생)
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20.08.28 14:05
cell은 L-M fibroblast 입니다.
nagative는 왼쪽으로 끌어서 배치해놓았고요...
실제로 해당 분양원에서 보내준 negative 자료도 같이 첨부해드리겠습니다.
cell 분화에 관련해서는 main으로 사용할 stem cell은 처음 seeding할 때 expansion media를 사용해서 확신이 없지만, 올린 data는 Ab검증용으로 분양받은 cell이고, 지정된 media를 사용했기 때문에 확실하게 나와야 정상이라고 알고 있습니다...
이 실험이 벌써 3번째다보니 문의를 넣어봤는데 분양원 측에서는 아무런 이상이 없다고 하더군요...
이건 정말 의문이네요....
이정도 테스트로 안나오는거면 모든게 맞다는 가정하에 다른 세포라고해도 모든 사람들이 믿을겁니다...
제가 마지막으로 얘기할 수 있는것은... 안티바디 문제인데 첫번째로 안티바디가 전부 분해됐거나 두번째 혹시.... 다른 종용으로 나온 안티바디를 쓰시는 것은 아니겠죠..? Human CD34에 바인딩하는거 쓰시는거 맞죠..? 저희 실험실에서는 mouse랑 human을 둘다 다루다보니 같은 안티젠 이름이라도 안티바디를 꼭확인해서 mu-CDxx 냐 human이냐를 확인하는데... mouse껄 사용중이신건 아니겠죠..? 실험실에서 flow를 자주 안하시는 것 같아 그럴 가능성은 낮겠지만 혹시나해서 여쭤봅니다..
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Arkadis
(대학생)
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20.08.28 16:49
현재 실험에서 cell은 mouse cell을 사용하고 있어서 anti mouse Ab를 사용하고 있습니다. 그 점에 관해서는 refference에서 cat no. 확인하고 구매할 때도 다시 한 번 anti mouse인 것을 확인했으니 확실합니다..
혹시 voltage로 결과를 조절하는 경우 어떤 방식인지 알 수 있을까요? 혹시나 operator분도 실수 하셨을 수도 있으니 확인차 저도 확인하고자 합니다.