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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 단백질 구조에 영향을 주지 않으면서 종결코돈을 다른 아미노산으로 바꿀 수 있는 방법이 있을까요??
알곰토토(대학원생)  | 08.14 20:49
첨부파일 파일첨부: 캡처.JPG (100 KB)
이미지 첨부파일

cloning을 하였는데 DNA 뒤에 V5와 His가 tagging되어있는 상태입니다.

 

그런데 DNA 마지막이 종결코돈으로 끝나면 DNA 뒤의 tag 역시 발현이 되지 않아 Western blotting시 V5와 His로 detection이 되지 않는다고 해서 종결코돈부분만 site directed mutagesis를 통해 다른 아미노산으로 치환해주려 합니다.

 

하지만 아미노산이 변경되면 단백질 구조까지 같이 바뀌는 경우가 생길 것 같아서 단백질 구조에 영향을 주지 않으면서 종결코돈을 제거하려면 어느 아미노산으로 치환해야할지 잘 모르겠습니다.

 

현재 sequence가 DNA---종결코돈(TAG)---V5---His 이 순서이고, 종결코돈인 TAG를 다른 아미노산으로 치환하고 싶은데 이 경우엔 어느 아미노산으로 많이 치환하시나요??

 

snap gene 사진 함께 첨부합니다. 노란 글씨가 DNA 끝부분, 파란색 박스가 종결코돈 TAG, 그리고 뒤에 V5와 His tag입니다.

#종결코돈
 
#cloning
 
#site directed mutagenesis
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.14 21:04  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

염기서열을 보면 종결코돈 뒤에 바로 V5가 붙어 있지 않는데 종결코돈을

그냥 빼면 됩니다.

알곰토토  |  08.14 21:20  

그렇다면 primer를 만들 때 종결코돈 앞과 뒤의 sequence를 이용해서 종결코돈만 제외하고 primer를 만들면 될까요?? 

단백질 구조에 변형이 생기진 않을까요?ㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  08.14 21:38  

어떻게 종결코돈을 뺀다는 건지 좀더 상세히 알려주세요.

 

알곰토토  |  08.15 09:27  

최종 목표는 Western blot시 tagging된 V5와 His로 detection을 하고 싶은데, 교수님께 여쭤보니 TAG 종결코돈을 site direxted mutagenesis를 통해 다른 염기/아미노산으로 mutation시키거나 제거하여서 DNA에서 종결이 되지 않고 V5와 His까지 발현이 될 수 있도록 하는게 어떻냐고 하셨습니다.

 

그런데 예를 들어 적혈구에서 아미노산 하나가 변경되서 낫모양 적혈구가 되는 것 처럼, TAG를 다른 아미노산으로 mutation시켰을 때 단백질 구조에 변형이 생길까봐 걱정이 되는 것입니다. 그래서 단백질 구조에 영향을 주지 않으려면 TAG에서 어떤 아미노산으로 mutation시켜야 할지 궁금합니다.

 

아니면 혹시 다른 방법이 있다면 추천해주시면 감사하겠습니다.

대왕개구리SPEED  |  08.15 11:27  

실험 목적이 아니라 실험 방법을 어떻게 할 예정인지를 질문했습니다.

종결 코돈을 제거할지 치환할지를 우선 정하세요.

종결코돈을 치환할 경우의 문제를 걱정하는데 vector 서열을 보면 V5 앞에

여러 아미노산이 붙어있습니다

종결코돈을 없애고 발현하면 V5 앞의 아미노산 +  V5가 붙어서 발현됩니다.

이 여분의 아미노산은 걱정되지 않나요?

따라서 별로 걱정하지 않아도됩니다.

알곰토토  |  08.15 14:48  

종결코돈과 tag 사이의 아미노산은 제가 놓친 부분이네요, 감사합니다.

 

종결코돈을 제거해도 큰 문제가 되지 않는다고 말씀해주셨는데

그렇다면 예를 들어 염기서열이 1-2-3-종결코돈-4-5-6-V5-His 이런 식으로 되어 있다면

site directed mutagenesis를 위한 primer를 제작할 때 1-2-3-4-5-6-V5-His 이런 식으로 제작하면 되는걸까요?? 

 

대왕개구리SPEED  |  08.15 15:03  

종결코돈 빼고 primer를 만들면 되는데 이 primer를 만들어 어떻게 실험할

계획인가요?

전체 vector 크기가 어떻게 되나요?

알곰토토  |  08.15 16:47  

Primer로 PCR을 진행한 뒤, PCR product에 Dpn1을 처리하고, purification 후 transformation, spreading, inoculation, 그리고 mini-prep 순으로 진행할 예정입니다.

 

DNA 사이즈는 867 bp이고, vector 사이즈는 5499 bp로

전체 사이즈가 6366 bp입니다.

대왕개구리SPEED  |  08.15 17:12  

또 다른 방법은

insert에 EcoR I자리가 없으면 EcoR I 자리를 기준으로 R primer에 종결코돈을

빼고 만들고 R primer는 EcoR I에서 V5방향으로 만들어 PCR하면 됩니다.

PCR후 EcoR I으로 자른 후 붙이면 됩니다.

염기서열 분석 후 종결코돈 확인과 base 에러가 없으면 발현하면 됩니다.

알곰토토  |  08.17 14:49  
혹시 EcoR1에서 V5 방향으로 만드는 프라이머는 F primer로 하면 된다는 말씀이신가요??
대왕개구리SPEED  |  08.17 15:17  

네.. EcoR I -> V5방향으로 F primer가 됩니다.

알구상  |  08.17 21:17  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

대부분의 경우, protein의 N-/C- terminal은 protein의 바깥쪽으로 드러나는 형태로 나타납니다. 또한 종결코돈은 그 자체가 amino acid가 없기 때문에 종결코돈의 유무는 protein amino acid sequence에 영향을 미치지 않습니다. 위에 답변에서 말씀하신대로 대부분의 경우에는, 종결코돈을 그대로 없앤 다음 이어 붙이려는 sequence를 그대로 넣어줍니다. 즉, 종결코돈부터 V5 tag 바로 앞까지 굳이 여분의 sequence를 넣을 필요 없이 바로 V5 tag이 붙도록 만들어주는 경우가 많습니다. Insert를 PCR 하면서 V5 바로 앞에 있는 restriction enzyme cut site와 overhang이 맞도록 만들어주고 cloning 해주시면 됩니다. 물론 in-frame이 되도록 디자인 하셔야 합니다.

 

Addgene에 있는 GFP reporter 또는 antibiotics selection vector 등을 참고해보세요. 대부분 발현하고자 하는 protein 뒤에 바로 다른 protein domain을 달아주는 형식으로 만들어줍니다. 서로 다른 protein의 domain을 연결해주는 것은 꽤나 간단하게 만드는 경우가 많습니다. 

 

CRISPR-Cas9 system에서 사용하는 Cas9를 예로들면,

1. eukaryotic cell에서 사용하기 위해서 NLS sequence를 앞 뒤로 달아주거나, 

2. Selection marker를 달아주기 위해 C-term의 stop codon을 없애주고 -2A-Blasticidin resistance sequence를 바로 연결해줍니다. 

(http://www.addgene.org/52962/)

이러한 경우에는 뒤에 연결해주는 sequence의 종결코돈만 남겨줍니다. 위 링크의 vector와 WT Cas9 sequence를 찾아서 비교해보면 도움이 될 것 같습니다. 

또는 아래와 같이 그냥 Cas9 바로 뒤에 6X His tag을 달아버리는 경우도 많습니다. 이런 형태가 오히려 더 일반적이죠.

(http://www.addgene.org/62374/)

 

Cas9를 기반으로 개발된 base editor (BE)나 prime editor (PE) 모두 Cas9 domain 끝 부분에 다른 protein domain을 붙여넣은 방식으로 이용했습니다. N-/C- term에 새로운 amino acid가 추가되는 것은 이와 같이 대부분의 경우 protein structure에 영향을 주지 않는 경우가 많습니다. 

 

Cloning 방법에 대해서는 T4 ligation으로도 충분히 가능하지만, 저희 연구실의 경우라면 gibson assembly를 이용합니다. 가격이 조금 비싸지만, 그에 필요로 하는 시간과 노력을 매우 절약할 수 있습니다. 

NEB에서 제공하는 Gibson assembly protocol보다도 훨씬 scale down (Total vol. 4uL)해서 반응시켜도 충분히 많은 colony를 얻을 수 있기 때문에 master mix를 사서 두고두고 쓰곤 합니다. 

 

공유에 민감하지 않은 vector라면, word 파일에 sequence와 gene of interest 부분을 표시해서 업로드 해서 질문하면 더 자세한 cloning 전략에 대해 답변받을 수 있을 것으로 보입니다. 

알곰토토  |  08.18 17:31  
두분 답변을 들어보니 종결코돈을 제거해야 되는 것도 있지만, DNA와 V5 tag 사이의 sequence들도 고려해야되는 사항이라 생각되어서
종결코돈부터 V5 앞까지의 sequence를 deletion하는 방향으로 실험하기로 하였습니다.

답변 감사합니다!
대왕개구리SPEED  |  08.18 17:47  

있어도 되고 제거해도 무방합니다.

있어도 되는 이유는 original 단백질에 붙이는 tag 또한 원래 가지고 있던

아미노산이 아니지만 붙여서 사용합니다.

실험자는 tag으로 생각하지만 단백질 입장에서는 원래 없던 여분의 아미노산일

뿐입니다.

따라서 실험자가 결정하면 됩니다.

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