실험 Q&A Immunology > Immunofluorescence
FACS 결과가 이상합니다... trouble shooting 도와주십시오...
레벨5 Arkadis (대학생)
선임연구원도 없이 FACS analysis를 계속해왔습니다.
처음엔 refference로 protocol을 따라하다가 타 기관에서 조언을 받아 FACS protocol을 변경했는데요...
아무래도 형광값이 이상하게 안 잡힙니다.
Ab가 아예 안 붙었으면 Ab문제라고 하겠는데 너무 약하게 나와서요..
염색은 100uL에 2-4 x 105 cell을 분취해서 20uL dye를 섞었습니다.
dye의 경우 제조사에서 1 x 105 cell 당 20uL을 사용하는 제품이라고 했지만, 실 사용자의 경험에 따르면 그 10배까진 형광이 문제없이 잡힌다고 했습니다.
반응 시간도 incubator에서 1시간 30분이나 하고 그 중 30분은 shaker까지 사용했습니다.
실험은 전부 암실조건을 갖춰줬는데 약간의 빛이 들어갔을 수 있습니다.
염색이 끝나고 foil로 감싸 ice bucket에 넣어 이동했고 마지막 washing 후 촬영까지 timewreck은 2시간 30분 정도입니다.
FACS analysis 할 때에는 2-4 x 105 cell을 1mL에 띄워서 진행하였습니다.
경험이 없고 선임연구원조차 없이 맨땅에 헤딩하다보니 아무리 생각해도 protocol에 문제를 찾지 못해서 질문 남깁니다.
어떤 문제가 발생했으며 어떻게 해야 되는 건지 부디 알려주시길 바랍니다...
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