실험Q&A를 통해 여러분의 지식을 나누어 주세요. 답변을 등록하시려면 로그인 해주세요.
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
-
레벨1
bbbbb
(대학원생)
-
20.08.11 01:12
아 BLOCKING 문제가 가장 유력하다고 생각했는데
BLOCKING은 1H동안 교반하여 진행하였고 5% BSA로 하였습니다!
그후 WASHING 하지않고, 바로 1차 항체를 붙였습니다.
혹시 이과정에서 WASHING을 거치지 않아 생겨난 문제일까요 ..??? 저는 어차피 1차항체 희석용매는 5% BSA니까 상관없다고 생각해서 안했습니다 ㅠ
그리고 1차항체는 COX-2와 B-ACTIN 를 한통에 넣어서 반응시켰습니다. 이것도 항체는 특이성이 있으니 상관없다고 생각했습니다.
(단백질 LOADING 농도는 15UG입니다!)
- antibody는 mouse유래 igG 2차항체를 사용하고 있습니다.
: 그럼 1차 항체는 어떤 걸 사용했나요?
모든 실험은 이론적인 배경을 잘 이해하고 진행해야 합니다.
washing, ab 처리 등 protocol에 맞게 진행 한 후 결과를 분석하는 것이 어디에
문제가 있는지 파악하기 쉬울 것 같습니다.
처음 단계인 전기영동 또한 lane간에 간섭이 일어나지 않도록 주의하는것이
좋습니다.
-
레벨5
힘들다힘들어
-
20.08.11 12:59
어...
아무리 항원-항체 특이성이 있다하더라도 멤브레인을 잘라서 각각 항체를 붙이거나...멤브레인을 자르지 않고 whole membrane에 target 확인 후 stripping 하여 House keeping gene을 detect 하지 1차 항체 두가지 종류를 섞진 않을 것 같습니다ㅠㅠ
네거티브 컨트롤로 1차 항체 없이 블라킹 후 2차만 붙여보세요.
동일 밴드가 보인다면 2차 항체의 비특이적 반응일수 있습니다.
깨끗한 멤브레인이 나온다면
1차 항체의 비특이적 반응일수있습니다.
근래에 네이쳐에 발표된바대로 pseudo-antibody들이 은근히 많습니다..
한마디로, 제 역할 못하는 바보 항체가 많이 판매된다는 뜻이지요..
그래서 일부 실험실에서는 target gene cloning을 수행하여 벡터 구축후
293T 같은 세포에서 과 발현 시킨후 항체 테스트를 진행하기도 합니다.
(해당 결과는 supplemen figure로 쓰기도 하지요- 우리가 사용한 항체가 제대로 워킹하는 항체다~ 라는 기본적인 정보를 주기위해)