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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western blotting ㅠ
알bbbbb(대학원생)  | 08.11 01:07
첨부파일 파일첨부: KakaoTalk_20200807_210129119.jpg (472 KB)
이미지 첨부파일

현재 western 한지 3주차인 초짜 대학원생입니다.

혼자 진행하다가 도저히 답이 안나와서 고수님들께 여쭤봅니다 ㅠㅠ

현재 저는 대식세포 (raw264.7)를 이용하여 sample 을 농도별로 처리해 cox-2의 활성저해분석을 하려고 하고있습니다.

항체는 cox-2, b-actin을 사용하고 있구요. antibody는 mouse유래 igG 2차항체를 사용하고 있습니다.

위 사진은 여러보안점을 보안한후 2번째로 WESTERN을 진행한 결과입니다.

몇개의 BAND들이 옆과 이어져 있는 부분들이 보이는데 이는 LOADING 시 옆으로 새서 나타난 결과라 깨달았습니다.

문제는 1차 항체를 2개 사용했는데 왜 여러개의 단백질이 촬영됬는지, 그리고 MARKER 부분은 제 생각에는 항체의 특이성이 있는 단백질이 없는데 흑색으로 끌리면서 나오는지.. 정말의문입니다. ㅠㅠ

고수님들 조언좀 해주세요 ㅠ

 

 

 

#WESTERN
 
#ANTIBODY
 
#COX-2
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알bbbbb  |  08.11 01:12  

아 BLOCKING 문제가 가장 유력하다고 생각했는데

BLOCKING은 1H동안 교반하여 진행하였고 5% BSA로 하였습니다!

그후 WASHING 하지않고, 바로 1차 항체를 붙였습니다.

혹시 이과정에서 WASHING을 거치지 않아 생겨난 문제일까요 ..??? 저는 어차피 1차항체 희석용매는 5% BSA니까 상관없다고 생각해서 안했습니다 ㅠ

그리고 1차항체는 COX-2와 B-ACTIN 를 한통에 넣어서 반응시켰습니다. 이것도 항체는 특이성이 있으니 상관없다고 생각했습니다.

(단백질 LOADING 농도는 15UG입니다!)

대왕개구리SPEED  |  08.11 09:37  

- antibody는 mouse유래 igG 2차항체를 사용하고 있습니다.

: 그럼 1차 항체는 어떤 걸 사용했나요?

모든 실험은 이론적인 배경을 잘 이해하고 진행해야 합니다.

washing, ab 처리 등 protocol에 맞게 진행 한 후 결과를 분석하는 것이 어디에

문제가 있는지 파악하기 쉬울 것 같습니다.

처음 단계인 전기영동 또한  lane간에 간섭이 일어나지 않도록 주의하는것이

좋습니다.

개구리힘들다힘들어  |  08.11 12:59  

어...

아무리 항원-항체 특이성이 있다하더라도 멤브레인을 잘라서 각각 항체를 붙이거나...멤브레인을 자르지 않고 whole membrane에 target 확인 후 stripping 하여 House keeping gene을 detect 하지 1차 항체 두가지 종류를 섞진 않을 것 같습니다ㅠㅠ

개구리빛초롱  |  08.11 18:51  

네거티브 컨트롤로 1차 항체 없이 블라킹 후 2차만 붙여보세요.

동일 밴드가 보인다면 2차 항체의 비특이적 반응일수 있습니다.

깨끗한 멤브레인이 나온다면

1차 항체의 비특이적 반응일수있습니다.

근래에 네이쳐에 발표된바대로 pseudo-antibody들이 은근히 많습니다..

한마디로, 제 역할 못하는 바보 항체가 많이 판매된다는 뜻이지요..

 

그래서 일부 실험실에서는 target gene cloning을 수행하여 벡터 구축후

293T 같은 세포에서 과 발현 시킨후 항체 테스트를 진행하기도 합니다.

(해당 결과는 supplemen figure로 쓰기도 하지요- 우리가 사용한 항체가 제대로 워킹하는 항체다~ 라는 기본적인 정보를 주기위해)

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