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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 Cloning 과정에서 질문이 있습니다.
알후기대학원생(대학원생)  | 08.07 10:46

현재 지금 후기 대학원으로 합격을 받고 인턴을 하고 있는 학생입니다.

 

지금 Cloning 실험을 하는 도중에 문제가 생겨서 다른 선배님들께 도움을 요청하기 위해서 글을 올리게 되었습니다.

 

실험에 사용하고 있는 insert(HA-FBXW4)와 backbone(pcdna3.1-ybx1-myc-his)을 사용해서 제한효소를 처리하고 ligation을 한뒤에 transformation을 해서 LB Plate(Amphicillin 첨가)에 spreading을 했는데 colony가 생기지 않고 떡이져서 생성이 되었습니다. (ligation을 할때 insert와 vector의 몰수비를 생각해서 비율을 정하는걸로 알고있는데 랩장님께서는 각각 1대1 비율로 2ul씩 사용해서 하라고 말씀해주셨습니다.)

 

실험실 내에 다른 선배님들께서 Com Cell을 사용하여 trasnformation을 진행 했을때는 colony들이 뜨는것을 확인했는데 com cell에 문제가 있는것 같아 보이지 않았습니다.

 

그래서 다른분들께 도움을 받을수 있을지 해서 글을 올리게 되었습니다.

#colony
 
#amphicillin
 
#cloning
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.07 11:11  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

ligation에 사용하면 안되는 V : I 비율은 없습니다.

경험 상 1 : 3. 1 : 4가 좋다는 얘기는 많지만 1 : 1도 불가능하지는 않습니다.

현재 상황에서 비율은 문제가 이니고 TF 후 균이 너무 많이 나왔다면

사용한 plate에 host 균만 배양해 보세요.

항생제 plate를 우선 확인해볼 필요가 있을것 같습니다.

알후기대학원생  |  08.07 11:15  

답변 달아주셔서 감사합니다. 어제 LB Plate(amphicillin 첨가)에 competent cell(dh5a)만 100ul를 도말하여 spreading 진행을 했는데 오늘 확인한 결과

colony는 생성이 되진 않았지만 약간 떡진상태로 자란것을 확인할수있었습니다. 이때에는 그럼 암피실린 농도에 문제가 있는걸까요??

실험실내에 1000x로 만들어져있는 amphicillin을 이용하였고 300ml에 300ul를 넣어서 굳혀서 사용했습니다.

지나가다  |  08.07 11:16   

앞으로 클로닝을 하면서 수없이 많이 겪게될 일들일겁니다.

먼저 떡이 되어서 나왔다는게 colony 구분이 없다는건지 아니면 자란건지 아닌지 모르겠으신건지는 모르겠으나 배지에 항생제가 제대로 작동하는것인지 알아보십시요. com cell을 그대로 깔아보시면 간단히 알수 있을겁니다. 그리고 걱정이 되시면 vector만 self ligation 해서 깔아보세요. vector 준비가 잘못되면 그럴수도 있습니다.

com cell에는 문제가 없다고 하셨으니 다음 문제는 제대로 ligation이 되었나하는 것이겠지요. 보통 ligation시 vector와 insert의 몰비는 1:3이 좋다고 하는것은 아시겠지요. 팀장님이 그렇게 하라는건 팀장님이 그렇게해도 문제없이 나왔으니까 그리하라고하시는거고 처음 배우실때는 mol 비를 계산해보는것도 초보자가 한번쯤은 해보셔야할 겁니다. 나중에는 아 이정도면 충분해 또는 벡터의 사이즈에 따라서 저정도면 되겠지하는 감이 생길겁니다.

그래도 mol 비로 계산하셔서 pcDNA 이니 3kb 수준일테고 insert가 1kb이면 vector 100ng에 insert 100ng 이면 몰비가 대략 1:3 정도 된다고 보시면 됩니다. ligation시 중요한건 ligation buffer 입니다. 보통 ligatuon buffer에는 DTT가 들어가있어서 특유의 냄새가 납니다. 하얗게 부유물이 떠 있기도 하고요. 냄새가 잘나는것이 좋습니다. 냄새가 없어지면 반응성이 현저히 떨어집니다. 하얗게 부유물처럼 떠있어도 문제없습니다. 

그리고 ligation은 어느 온도에서 해도 무방합니다. 16도로 하라고 그러는데 그렇게해서 잘나올때도 있지만 4도에서 RT, 37도까지 해본결과 ligation반응은 다 잘 일어납니다. 제한효소로 제대로만 잘려 있으면 문제없습니다. overnight ligation 하는건 시간낭비입니다.

형질전환시 heat shock후에 incubation  시간을 주는데 ampicillin 을 이용하는 경우 그럴 필요없습니다. heat shock후 ice에 잠깐 두었다가 그래도 spreading 해보세요. colony 문제없이 나옵니다. ampicillin 은 세포벽 합성을 저해하는 항생물질이므로 대장균을 죽이는게 아닙니다. 그래서 굳이 incubation 시간을 주지 않아도 형질전환된 대장균들은 colony를 만들게 됩니다.

DNA를 준비하실때 깨끗하게 준비하시고 잘 잘렸는가도 확인하시고 해보세요. pcDNA는 그리 큰게 아니므로 문제없이 잘될겁니다.

 

 

대왕개구리SPEED  |  08.07 11:33  

균이 자란 plate 사진이 있나요?

CP cell만 spreading해도 균이 자란다면 plate문제일 가능성이 높습니다.

- 실험실내에 1000x로 만들어져있는 amphicillin을 이용하였고

: 1X 농도가 어떻게 되나요?

그리고 plate에 문제가 있든 없든 균이 뭉쳐서 자라는 것은 spreading skill에도

문제가 있습니다.

알후기대학원생  |  08.07 12:24  
첨부파일 파일첨부: com cell.jpg (86 KB)
이미지 첨부파일

배지에 spreading시에 알코올램프 켜놓고 진행을 했습니다. 

대왕개구리SPEED  |  08.07 12:27  

이것은 균이 자란게 아니라 spreading 할 때 CP cell이 많아서 균체 자체가

보이는 겁니다.

CP cell을 혹시 100ul 이상 spreading하나요?

CP cell의 TF 효율은 어느정도 되나요?

알후기대학원생  |  08.07 12:45  

spreading시에 100ul로 도말하였고 com cell의 효율은 별로 좋지 않았던것 같습니다. com cell을 다시 만들어보거나 transformation 과정에서 문제가 있었던것으로 생각이 됩니다.

대왕개구리SPEED  |  08.07 13:00  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. CP cell은 TF 효율이 좋은걸 사용하세요.

2. TF 과정 보다 ligation이 잘되었는지 전기영동으로 확인한 후 TF 하세요.

3. ligation이 잘 되려면 vector와 insert를 잘 만들어야합니다.

알약대가자  |  08.09 23:17  

competent cell 자체만을 spreading

cutting하지 않은 vector만을 TF한 뒤 spreading

cloned vector를 spreading

이렇게 세 가지 실험 같이 해보세요

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