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 전체 > Molecular Biology-RNA > mRNA Analysis
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질문 mRNA gene expression 결과 해석 (멜팅커브는 잘 그려졌는데 결과가 이상할때..)
알로봇의비밀(과기인)  | 08.06 20:07

 

안녕하세요..

지금 현재 한가지 식물에 대해서 상위,하위 유전자 발현을 real-time PCR을 이용하여 계속해서 분석하고있습니다.

여러가지 유전자들 중, 어느 몇 몇개의(13개중 2개) 유전자 결과가 예상한대로 나오지 않습니다.. 

멜팅커브는 잘 그려졌는데 처리구별로 큰 차이를 보이지 않아 프라이머 문제가 아닐까 생각하고 있습니다.

하지만 어떤것이 문제인지에 대해 지식이 없어서 감이 잘 안옵니다..

멜팅커브는 1개로 잘 그려졌는데 결과가 좋지 않을 경우엔 어떤 원인이 있나요..? 프라이머가 잘못됐는지 알수있는 방법은 어떤것들이 있나요..?

절박해서요.. 아시는 선배님들에 대한 답변 기다리겠습니다 ㅠㅠ

감사합니다..

#melting curve
 
#mRNA gene expression
 
#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.06 20:45  

primer가 잘못되었으면 증폭 자체가 안되었을겁니다.

primer 가 정상적으로 작동하여 있는 그대로의 mRNA가 측정되었다고 보이며

현재 대조군 대비 처리군에서 양적 변화가 있어야 할 gene 2개는 현재 밝혀져

있는 gene 인가요 아니면 연구로 밝혀야 할 gene인가요?

알로봇의비밀  |  08.07 12:07  

네 답변 감사합니다.

2가지 모두 현재 밝혀져 있는 gene이며 많이 분석하고 있는 유전자들입니다.

2가지 말고 또 다른 유전자 분석 중, 멜팅커브가 2개가 검출되어 새롭게 프라이머를 제작한 유전자가 있는데, 그 때와 결과가 동일하게 나왔습니다..

그래서 아마도 프라이머에 문제가 있지 않을까 생각하고 있습니다.

 

한가지 걸리는 것은 제가 프라이머를 디자인할때 primer3 사이트를 이용하였고, 거기서 1번째로 추천한 프라이머를 사용했는데요..

제작된 프라이머 염기서열이 cccc 와 같이 4개가 동일하게 연속되는 것이 있는데 이게 문제가 될 수 있을까요..? 4개 이상 동일하게 염기가 반복되면 비특이적인 증폭이일어날수 있다고 하는데,, 이럴 경우에도 멜팅커브는 정상적으로 나타날 수 있는건지.. 잘 모르겠습니다..

 

이것이 문제가 아니라면 또 다른 원인은 무엇이 있을까요..?

답변 부탁드리겠습니다....ㅠㅠ 

감사합니다.

 

대왕개구리SPEED  |  08.07 13:13  

primer 문제로는 보이지 않습니다만 새로운 서열로 primer를 만들어

실험해보는 것도 원인 규명을 위해 좋을 듯 합니다.

아무리 프로그램에서 primer를 디자인해 줘도 실험자가 확인을 해야합니다.

동일 base가 연속으로 있어도 문제가 발생할 때도 있고 발생하지 않을수도

있습니다.

house keeping도 함께 측정하죠?

sms67022@naver.com  |  08.07 17:05   

답변 감사합니다.

 

멜팅커브가 잘 그려졌으면 프라이머 문제로 볼 수 없는 건가요..?

결과가 이상한 2 유전자의 결과와.. 멜팅커브가 2개로 그려진 프라이머의 결과가 아주 동일하고, 발현이 거의 안된 것처럼 보입니다.

프라이머에 뭔가 문제가 있는 것 같긴한데요..

딱히 문제점을 확인할 수 있는 방법이나 원인은 따로 없을까요??

 

그리고 housekeeping gene도 함께 분석하고 있고,

Actin과 결과값이 거의 비슷합니다 (특정 한 포인트를 제외하고)..

답변 주시면 감사하겠습니다..

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