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질문 Real-time PCR cell 보관방법 및 기간 질문있습니다.
개구리해브어굿타임(대학생)  | 08.05 15:09

Real-time PCR을 돌리려고 할 때
아무 물질도 처리하지 않은 control cell pellet과
독소를 처리한 treated cell pellet 
이 두 샘플들 보관 방법이 궁금합니다.

Cell 자체를 동결시킨 후 aliquot하여 사용하는 것인지?
PCR을 통해 DNA를 증폭시켜 전기영동을 하는 것이니
RNase를 처리한 상태로 동결시킨 후 사용하는 건가요??

그리고 sample 보관 기간과 보관온도도 궁금합니다!!

#real-time PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.05 15:12  

질문이 정리가 안되어있는 것 같은데 realtime PCR로 무엇을 측정할 예정인가요?

무엇을 측정하는 것과 관계없이 cell은 sample처리가 끝나면 바로 사용하는것이

좋습니다.

개구리BlackSmile  |  08.05 15:36  

현재 Cell pellet상태라면 RNA 분리 후 cDNA까지 합성하거나, DNA를 분리한 후 aliquot해놓는게 가장 좋은 방법입니다.

윗 분께서 말씀해주신 것처럼 생물학 실험에서 sample은 나온대로 즉시 사용하는 것이 가장 좋습니다.

 

저의 경우 RNA는 -80도, cDNA는 -20도에서 보관하는데, 보관 기간보다 중요한 것은 Freeze-thaw cycle을 많이 거치지 않는것입니다. 얼려두었던 sample이라고할지라도 몇번 녹였으면 실험에 사용한 후 재사용하지 않습니다.

올챙이콩순이  |  08.05 20:52  
Cell을 얼리실때에는 물기가 거의 0에 가깝도록 suction깨끗하게 해서

pellet 상태로 얼리시길 바랍니다. (aliqout이라니, 물기가 있어보이네욬)

Cell pellet에 RNase 처리하면 RNA 다 없어져서 real time PCR 못해요 ㅎㅎㅎ



독소를 처리한 세포와 그렇지 않은 세포에서

유전자의 발현(RNA transcript)이 어떻게 바뀌는지 보고싶은거죠?

gDNA는 변하지 않고 불변이죠. 특히나 같은 세포라면
gDNA는 똑같을거고
갑자기 chr의 translocation이 독소때문에 일어나는것도 아니고 ㅋㅋ epigenetics를 PCR로 보실것도 아니고 ㅋ
독소가 강력한 mutagen이여서 mutation이 난다한들 cell line을 가지고 mutant 연구를 하지도 않을거잖아요 ㅋㅋ

세포에 어떤 외부 환경이나 자극에 의해서 변하는건,

gDNA 유전자에서 발현이 변화되는 역동적인 transcript. RNA 일겁니다.

RNA 발현이 변하면

(어떤 유전자는 발현을 멈추고, 갑자기 독소때문에 죽는 데 관여하는 유전자 들이 발현을 시작하고. 아니면 염증에 관여하는 유전자들 발현이 일어나고 ) 그러면 protein도 변하는건 인지상정. 웨스턴으로 시그널 pathway 할꺼잖아요. 그쵸? 센트럴도그마 -



그러나, 역동적인 RNA는 매우 불안정한 상태입니다.

잘 아시다싶이, senstive, unstable 등등..수식어가 많은 것처럼

RNA로 PCR을 한다? 실험 준비하는 동안 다 degradation -

endproduct의 결과값도 reliable하지 않을겁니다.

그러니 사람들이 cDNA로 변환시켜서 PCR 하죠.



보통 이런경우, 사람들은 cell pellet을 얼릴때, RNA가 degradation되는것을 보호하기 위해서. RNaseOUT, RNase inhibitor를 cell pellet에 2ul 씩 펠렛마다 넣어주어 -80도 보관했다가 씁니다. 보통은 이런저런 처리안하고 펠렛만 얼려놨다가 바로 실험합니다.늦어도 일주일안에! 질문자님처럼 RNase 처리하면 정확히 그 반대. 폭망 ㅋ


cell pellet 일때가 그나마 안전하고 (-80도 보관)

Trizol에 cell pellet을 완전히 resuspension해서 -80'c에 보관

(다음날 바로 만드시거나, 늦어도 2주일안에 cDNA 만드시기를)



RNA 분리한 상태로 한달~ 3달, 최대 1년 (-80'c)

cDNA로 변환뒤 -20도에 몇년.



qPCR할꺼면, RNase 넣지 마요~~ 진짜~ ㅋㅋㅋ



화이링~
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