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질문 western blot으로 특정 인자 band만 계속 안나옵니다 (bcl-2 보신 분 도움 부탁드립니다)
올챙이진저브래드트윅스(대학원생)  | 08.04 13:08

안녕하세요, HepG2 cell로 실험 진행중인 대학원생입니다.

 

다름이 아니라 western blot으로 각종 인자들의 발현을 보는 중인데, bcl-2 band가 계속 안나옵니다 ㅠㅠ

 

단백질량을 60까지 올려서 실험도 해보고, 노출 시간을 3시간으로 늘려보기도 하고, ecl solution을 강한 것으로 사용하여 실험해보기도 했는데 흔적조차 나오지 않네요,,ㅜㅜ

 

bcl-2가 중요한 인자라 꼭 나와야 하는데 한 학기 째 나오지 않아 걱정입니다. 혹시 도움 주실 수 있는 분 있으신가요?

#westernblot
 
#bcl-2
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리무광  |  08.04 13:24  

1. antibody는 바꿔보셨나요?
 1- 다른 세포에선 해당 항체로 Bcl-2 검출이 됐었는지? (혹은 positive control에서) 
2. Bcl-2는 분자량이 좀 작았던 걸로 기억하는데 다른 저분자 단백질들은 잘 나오시는 지?
3. 아니면 일단 Ponceau S로 봤을 때 Bcl-2가 나올 사이즈에 밴드들이 잘 나오나요?
4. qPCR로 mRNA 발현량은 어떤지 체크해보셨나요

개구리Q.E.D.  |  08.04 13:39  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
첨부파일 파일첨부: Screenshot_20200804-133718_Adobe Acrobat.jpg (45 KB)
이미지 첨부파일
방법은 어떻게 하셨는지 모르지만
우선 제 항체 리스트를 보니
저 항체로 1:500을 했을 때 밴드가 수월하게 나왔었어요 참고하세요
Base는 1% skim milk입니다.
BSA라고 안 써둔걸 보니 그걸로 하면 안 나왔었나봐요^^

1차 항체만 200여개가 넘어서 다 기억 안 나네요ㅋㅋ

혹시 본인이 이렇게 종류를 많이 실험을 하면
조건 표를 만들어 두면
다음번에 하기 편해요~

그리고 28kDa정도라서 완전히 작은건 아니지만
gel %를 12.5%정도로 해 보고
그래도 안 나오면 glycine base gel 말고
Trycine?이었나 스펠링 맞나요ㅋㅋ
이걸 베이스로 한 겔 쓰세요
이게 작은 분자 단백질을 좀 더 잘 잡아요~
그럼 수고하세요!
개구리안녕난세포야  |  08.07 07:53  

해볼건 많습니다만.. 오랜 시간을 끌은 만큼 한번에 할 수 있는 것을 최대한 다 해봐야할것같습니다.

1. blocking solution: BSA와 skim milk 각각 

2. sample buffer 다시 만들기 또는 다른종류의 샘플버퍼 사용해보기

3. expose 후 membrane을 amido black 또는 ponsue s로 염색해보기

4. 다른 Ab 사용해보기

5. transfer가 semi-dry 방식이라면 wet, O/N으로 해보기

 

이정도 생각이 나네요

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