[DEBUG-WINDOW 처리영역 보기]
즐겨찾기  |  뉴스레터  |  오늘의 정보  |  e브릭몰e브릭몰 sale 회원가입   로그인
BRIC홈 실험
검색광고안내
시마즈(SHIMADZU) 제작소 탐방기 - 1편
스폰서배너광고 안내  배너1 배너2 배너3 배너4
과학으로 본 코로나19 (COVID-19)
전체보기 안전점검 논문교환 LABox
 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
조회 497  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 11,000 bp와 12,000 bp의 vector를 전기영동으로 구분할수 있을까요 ?
알마이어(대학원생)  | 08.03 23:24

벡터를 만들고 있습니다. 

본래 12,000bp의 backbone에서 900bp 정도 길이의 단편을 절단하여

gel extraction을 하는데 이것을 전기영동상에서 구분해서 elution을 할 수 있을까요 ?

그냥 one band로 보고 elution하는데 계속 test digest시 backbone그대로의 결과가 도출되서 여쭤 봅니다.

 

900bp 서열 절단시에는 overnight도하고 충분한 시간을 주고 gel extraction에 들어가는데 계속 backbone이 혼입이 되네요 ...

 

조언 해주시면 감사하겠습니다.

#gel extration
 
#전기영동
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.04 00:10  
구분가능하고 elution 가능합니다.
물론 기술적 문제이기 때문에 누가하더라도 모두 가능하지는 않습니다.
자르는 것은 o/n하지 않아도 되며 전기영동 조건은 어떻게 되나요?
그리고 elution을 위한 전기영동시 사진은 있나요?
콩순이  |  08.04 11:43   

1. 쓸수 있는 DNA인가

우선적으로 하실일은 12000 bp의 DNA가 쓸수 있는 상태인지 확인바랍니다. 흔하디 흔한 엔자임 EcoRI, BamHI, XhoI, BsrGI, XbaI 들로 구조가 정확한지 부터 확인하세요. Sequence map과 확인후 확실하다면 다음으로 넘어갑니다. 

 

2. 왜 Backbone을 11000 을 얻으려고 하나

Backobone에서 unique / single cut enzyme 사이트를 하나 더 잘라서, BB을 2개의 조각으로 내서 확인하면 쉽습니다. 

예를들어 4000 + 7000 vs 5000 + 7000  확인하기가 더 쉽고, 나중에 라이게이션도 더 잘될겁니다. 분자량. 그러니까 11000bp 짜리 엄청나게 큰 덩어리와 미니미니 insert를 붙이는 과정은 쉽지 않을겁니다. 3 fragment ligation은 어렵지 않은 일이니 BB을 2조각으로 만드는걸 권장합니다. 더군다나 11000bp는 DNA가 서로 엉겨붙어있어 라이게이션도 쉽지 않을겁니다. (정 원하시면 파트에서 부연설명드리겠습니다) 

그정도 크기면, 쓸수 있는 엔자임 싸이트가 없어용~ 이러실것 같은데

하다못해, Amp 저항성 유전자에 ScaI, CMV promoter에 SnaBI 등 찾아보면 있습니다.  

혹시라도, Lenti virus 벡터를 만드시는 중이면, 렌티바이러스는 10000 bp 이상 넘어가면 바이러스 파티클 안에 패키징이 안되어 효율이 엄청나게 떨어짐을 유념하고 만드시기 바랍니다. 

 

3. 정말로 정~ 원하시면 방법은 있습니다. 

튜브를 4개 준비하신 다음 

(1) 클로닝 싸이트 A single cut

(2) 클로닝 싸이트 B single cut

(3) (4) 클로닝 싸이트 A, B 더블컷 

(3)은 1ug DNA digestion / (4)은 2ug DNA disgestion, 엔자임양도 두배 

정상적으로 digestion 수행하신다음에, 젤에 걸어서 

"800bp"가 정확히 빠져나왔는지를 확인하세요. 

BB의 양이 95%를 차지하는 경우, insert의 양이 희미하게 보일수 있기때문에 1ug, 2ug 두가지 버전으로 확실히 insert 800이 빠져나가는걸 확인해야합니다.  

 

100v 로 4~6시간 젤을 run해서 DNA의 위치가 젤 아래 1/3 지점까지 길게 run하세요. 10000 bp 이상의 DNA가 안잘린것, 잘린것, 잘리다 만것 들이 BB에 다 엉겨붙어 있으니 최대한 separation을 해야합니다.  최대한 cut이 완벽한 상태인지를 싱글컷들과 비교해서 정확히 컷해 내십시오.  

 

(교수님 몰래 enzyme double cut 튜브를 2개나 3개쯤 여러개 자르세요. 시약 낭비하는 것보다, 백본 내리느라 걸린 내 시간이 더 아깝습니다 ㅋㅋ

 

여차저차 BB을 얻었다면, 라이게이션에서도 막힐텐데

라이게이션 전에는 95-98도에서 1-2분 heat을 한다음에 얼음에 바로 넣어 self aggregation 된애들을 풀어준다음 ligation을 진행해야합니다. 

 

화이링~ 

 

 

알마이어  |  08.04 23:06  

답변 많이 도움되었습니다! 

혹시 여쭤보고 싶은것이 더 있는데, 

self aggregation 해결 방법이 95도에서 2~3분 처리 후 얼음에 급격하게 cool down하라고 하셨는데 이때 이중가닥이 풀릴 가능성은 없나요 ?

 

또 벡터에 unique한 enzyme 서열이 또 있어서 단편으로 잘라보려고 하는데 이때 insert하고 backbone 두 가지 pmol을 1:1:1로 만들어서 T4 ligation하면 될까요 ?

올챙이콩순이  |  08.05 11:04  
self aggregation 해결 방법이 95도에서 2~3분 처리 후 얼음에 급격하게 cool down하라고 하셨는데 이때 이중가닥이 풀릴 가능성은 없나요 ?

--> 앗, 제가 점심먹기전에 급하게 쳐서, 오류가 났었네요 ㅋㅋ

65도 2-3분입니다. ㅋㅋ;;;



또 벡터에 unique한 enzyme 서열이 또 있어서 단편으로 잘라보려고 하는데 이때 insert하고 backbone 두 가지 pmol을 1:1:1로 만들어서 T4 ligation하면 될까요 ?

--> 제 경험상으로 DNA bp 길이/ 농도/ 분자량 /비율 따지면서 해봤었는데

Total ligation 되는 DNA 양이 100 ng 언저리로 ligation 하는게 베스트.
fragment 끼리는 거의 비슷하게 넣는게 젤 잘되더라구요. 백본만 조금더.

(이건 사이언스 아니고 노하우)

A : B : C 일때,

대략 40 ng + 30 ng + 30 ng

혹은 50 ng + 40 ng + 40 ng

그리고, T4 ligase는 당연 좋은데요,

중요한건

혹시라도 sticky end 가 서로 self를 만드는건 아닌지 Backbone에 양쪽이 blunt end인지 확인해야할 것 같은 느낌이네요. 무슨 엔자임 싸이트 쓰시는지 모르겠지만, BB의 cloning site가 blunt이면 CIAP 혹은 SAP 처리하시는건 아시겠죠? (양쪽이 모두 Blunt end일때만 해당)

3조각으로 클로닝할때, overhang에 나오는 sequence가 insert없이 다시 bb끼리 붙을 수 있는건 아닌지 확인하시구요.

뭐 옆랩이거나 아는사람이라면 더 자세히 설명드릴수 있겠지만..

자세한 information이 없는 상황에서 이정도만 설명해 드리져 ㅋ

젤 마지막 말이 무슨말인지 모르시겠으면

Sal I, Xho I

BamHI, Bgl II 엔자임을 시퀀스와 잘리는 부분 sticky end 그림을 그려보시면 알수 있어요.





그리고, 이건 마지막 여담이지만

랩에서 클로닝을 체계적으로 하지 않을경우

그러니까, 맥시 프랩할때 트랜스포메이션을 해서 콜로니를 따고

콜로니를 각각 미니프랩을 해서 엔자임으로 구조확인하고

구조 확인이 된 정확한 미니프랩 박테리아 남은걸로 맥시프랩을 하는 방식이 아니라, 대충대충 맥시 프랩하고 확인안하고 걍 뿔리고 그러시면은

확실히 이상한 plasmid들이 계속 섞여서 DNA tube에 같이 있겠죠

그럼 잘라도 안잘리고, 사이즈도 안맞는 이상한 DNA들때문에

시간 열정 재료 낭비하다 끝날수도 있어요.



클로닝은 한단계 한단계 완벽하게 확인하고 진행하지 않으면,

그 DNA로 실험까지 하고 나서 몇달 혹은 1년뒤에

다시 DNA로 돌아오는 경우가 허다하니, 지금 확실히 하고 넘어가시길 바래요.



화이링~
올챙이콩순이  |  08.05 21:53  
혹시라도 이렇게도 저렇게도 해봐도
1달 이상의 삽질의 나날이 지속되거나
뭐라는지도 모르겠고 엔자임도없고
코로나때메 수입도 몇달 걸린다하고
눈물나고 다 때려치웠음 좋겠다 생각들면
연락주세요.
3일안에 미니프랩해서 시퀀싱 보내고
4일안에 시퀀싱결과확인해서
5일째 되는날엔 고순도 maxi prep된 DNA를 만나게 해드릴게요 ㅎ
답변하기
할인행사 광고 검색광고
케이비티 케이비티
Mixer, Dry Bath, Heating Block, Thermo Shaker, Shaking Incub.. (10.22까지)
다온비에스 다온비에스
내 소중한 세포를 위해 안심하고 맡길 수 있는 WOLF Cell Sorter를 경험하세요! (12.31까지)
필코리아테크놀로지 필코리아테크놀로지
무료 샘플로 명품 NEB의 DNA/RNA Purifucation 성능을 경험하세요. / COVID-19 연구.. (9.29까지)
에펜도르프코리아 에펜도르프코리아
[에펜도르프코리아] Eppendorf 2020 하반기 프로모션 행사 : 실험실 필수품 피펫,원심분리기,PCR.. (12.31까지)
인성크로마텍 인성크로마텍
Phenotype MicroArray™ - Live Cell 에너지 대사 & 감수성 프로파일링 (10.31까지)
브래디 브래디
[브래디] 초저온라벨 등 실험실용 라벨링 솔루션 (COVID19 안전사인 등) (10.30까지)
그린메이트바이오텍 그린메이트바이오텍
TECAN 한국대리점 20주년 기념 Microplate Reader & Washer 할인이 쏟아진다! (12.31까지)
프리미엄 등록안내
외부제휴사 광고 AD
e브릭몰
5/6  좌우
136,000
139,000132,100
242,40072,800
22,7006,900
80,40024,200
47,20044,900
739,000702,100
388,500116,600
793,400238,100
887,200266,200
158,40047,600
924,000
143,800136,700
245,20073,600
555,000
136,000129,200
246,60074,000
79,50075,600
309,000
50,00015,000
238,70071,700
379,000
230,000
201,30060,400
최근등록   더보기 >
PCR primer design에 대해서 알려주세요 ㅠㅠㅠ   09.19
증균액과 희석   09.18
분자요리 캐비어 원리   09.18
DNA digestion 프로토콜   09.18
미생물 분리 동정 실험 준비물   09.18
고체배지로 측정한 낙하균을 액체시료로 쓸 수 있는 방법이 있을까요??   09.18
BSA standard curve.. 질문 ..   09.18
RNA 추출시 RNA degradation이 일어나는 문제가 있습니다.   09.18
Callus 유도와 관현하여 질문드립니다! ( 병풀 캘러스 유도 해보신 분 있으실까요?)   09.18
cell seeding 계산입니다.   09.18
에스엘에스바이오
실험관련연재
박은총 연재중후배에게 주고 싶은 면역학 노트
박은총(Duke University)
신코 연재중분석장비 이야기
분석장비 탐험가 (필명) ((주)신코)
Mr.S 연재중의학계의 Spectaculum: 임상시험
Mr. S (필명) (연세대학교)
에스프리 연재중실험을 해봅시다
에스프리 (필명)
곽민준 연재중랩노트
곽민준 (POSTECH 생명과학과)
이제욱 연재중생명과학자 기초체력 다지기
이제욱 (오송첨단의료산업진흥재단, 신약개발지원센터)
ZEUS
위로가기
실험 홈  |  실험FAQ  |  실험 문의 및 제안
 |  BRIC소개  |  이용안내  |  이용약관  |  개인정보처리방침  |  이메일무단수집거부
Copyright © BRIC. All rights reserved.  |  문의 member@ibric.org
트위터 트위터    페이스북 페이스북   유튜브 유튜브    RSS서비스 RSS
에펜도르프코리아 광고