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 전체 > Cell Biology > Transfection
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질문 kanamycin ampicillin vector co transfection
알석사.(대학원생)  | 2020.08.03 12:59

요즘 transfection을 하는데 A,B를 같이 trasnfection을 하면 A랑 같이 들어간 protein(B가 아니여도)은 계속 expression 이 약해지거나 발현이 안됩니다. 

 

A는 kanamycin, B는 ampicillin resistance vector인데 이게 문제가 될수도 있나요.....?

(kanamycin, ampicillin resistance vector를 같이 cotransfection 시키면 발현하는데 문제가 있다던지............ㅠㅠ)

 

#transfection
 
#kanamycine
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2020.08.03   

1. 두 vector의 ori가 어떻게 되나요?

2. 항생제 넣고 배양하면 몇시간 정도 배양하나요?

3. promoter가 어떻게 되나요?

대왕개구리강시  |  2020.08.03   

세균에 transformation 한건가요?

아니면,

Cell에 transfection 한 것인가요?

알석사.  |  2020.08.03   

cmv promoter이고, cell에 transfection 시킨거에요... 그리고 vector map보면 SV40ori입니다. 

 

대왕개구리SPEED  |  2020.08.03   

항생제하고는 아무런 관계없습니다.

다른 이유를 찾아봐야 할것 같고 2개 vector에서 각각 동일하게 발현 시키기는

어렵습니다.

항상 한쪽이 사라진다면 one vector co-expression하면 됩니다.

 

올챙이콩순이  |  2020.08.05   
오답입니다- 만 상상력은 풍부하시네요 ㅋ



일단 플라스미드 구조에 대해 말씀드리져, 이렇게 상상력이 풍부하시니

그에 맞게 설명드리면

동그란 플라스미드 구조 그림을 보면, 크게 왼쪽과 오른쪽으로 나눌수 있어요.

왼쪽 파트는 박테리아에서 살아남을 수 있는 구조들과

오른쪽 파트는 mammlian cell에서 expression 시킬 용도로 사용되는 구조죠.



mammalian cell은 Promoter에서부터 RNA transcript 시작

내가 원하는 유전자를 지나 벡터에 있는 poly A signal에서 끝-

(보통 SV40poly A)



그러고 나면, F1 ori가 보이십니까? 그때부터는 박테리아에서 발현됩니다.

mammalian cell과 prokaryotic은 transcription이 완전히 다르다고

분명히 교수님이 학부때 말해줬을텐데, 딱 그거 설명할때만 잠깐 눈을 감고 명상을 하셨던거 같으니 지금이라도

책을 다시펴서 공부하시길 바랍니다. 발현도 안되는 불쌍한 ampicillin, kanamycin resistant 유전자 서열이 항생제도 없는 상황에서 단백질은 커녕 RNA도 못만드는데 무슨 죄가 있다고 ㅋㅋ



오히려, Transfection 컨디션이 더 걱정인데요?

1번 웰 TF는 A 유전자 3ug

2번 웰 TF는 B 유전자 3ug

3번 웰 TF는 A+B 유전자 1.5 + 1.5로 토탈 3ug으로 맞추셨으면 희석

3+3ug을 했으면 너무 많이 했고.. 등등의 문제들

(혹시라도 electroporation을 그냥 circular plasmid 로 하셨으면,

정말 ㅋㅋㅋ 꼭 알려주세요 ㅋㅋㅋㅋ )



혹은 나노드랍을 대충 재서, A유전자 가 1ug인줄 알았는데 알고보니 3ug이고

B유전자가 1ug인줄 알았는데 알고보니 0.8ug이었다면, A가 더 우세하겠네요. 혹은 DNA quality가 A는 purity가 높고, B는 더럽게 뽑힌 실험실에서 몇년 굴러다니던 DNA라면 더 말할 것도 없구요.



이도저도 아니라면, A 유전자가 B를 suppression하는 역할을 하던가요.



아시다싶이, TF는 Transient 한 expression을 보는 과정이기 때문에

정말 서로의 유전자가 발현을 방해한다고 생각되면, 장기적 관점으로

바이러스 컨스트럭트를 만들어서 이렇게 해볼 순 있겠네요.

A 유전자가 neomycine resistant하고

B 유전자가 puromycin에 resistant 하다면

A 유전자를 neo로 selection해서 100프로로 만든 다음에

B를 넣어 puro로 selection해서 살아남는 세포를 쓰던지

반대로 하시던지..



A 유전자는 GFP

B 유전자는 puromycin이라면

A 유전자를 발현시켜 100프로로 만들거나 sorting을 해서 100을 만든 다음에 B 유전자를 넣고, puromycin selection을 해서 살아남는 GFP+ puro를 쓰시던지.. 이것도 puromycin 이나 GFP를 벡터에 가지고 있을때를 말합니다.



그냥 co-TF에서 100퍼센트 TF가 되었다고 어떻게 알수 있죠?

두개의 DNA를 넣었다고 모든 세포가 다 A와 B를 가지는 세포라고 어떻게 말 할 수 있죠?



말이 길어졌지만, ampR와 kanaR 유전자 염기서열은 mammalian cell에서 죄가 없습니다. ㅎ


그리고 비밀은 아니고 알사람들은 다 아는건데
Transient TF하고나서도 stable cell line을 만들수 있답니다. 원하시면 다음기회에 말씀드리죠

화이링~
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