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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 DNA 전기영동 시 smear 현상 문의ㅠㅠ
알멘붕노예(대학원생)  | 08.01 10:24

안녕하세요..

대학원생입니다..

 

현재 PCR을 이용해서 DNA증폭 후 전기영동을 했는데,,,

결과가 너무 들쭉날쭉해 고민입니다.

upload_image

위의 사진은 같은 샘플(DNA가 존재하는 것으로 확인된 양성 샘플)을 전기영동 test 한 사진입니다.

모두 120bp쯤에서 밴드가 떠야 하는 양성 샘플입니다.

(* nested PCR 진행)

그런데, 1) 어떤 것은 잘 뜨고 어떤 것은 위에서 아래로 smear하게 보여서 무엇이 문제인지 알고 싶습니다.

 

심지어,, 2) 음성(가장 마지막 샘플/ N으로 표기) 샘플도 컨탐인지............

근데 nested PCR 에서는 너무 많은 cycle을 거쳤기 때문에 저렇게도 보인다고는 하던데,,,ㅠㅠ

 

gel이 문제 인가 싶어(* 현재 1.5% agrose gel 사용) 다시 만들어 실험해보았으나, 결과는 똑같았습니다.......ㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

 

고수님들,, 살려 주세요..

 

** smear 현상이 보이는 이유에 대해 알고 싶습니다.... 다양한 이유가 있다고는 하지만.... 부탁드립니다..

#전기영동
 
#smear
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  08.01 10:44  

N에서 증폭이 일어났기 때문에 전체 시료에 대한 신뢰성에 의문이 들고..

PCR에 대한 정보가 상세 정보가 없기 때문에 원인을 파악하기 힘듭니다.

알멘붕노예  |  08.01 10:56  

< PCR 정보 >                                

  1st(ul) 2nd(ul)
10*PCR buffer 2.5 2.5
2.5mM dNTP 2 2
primer(10pmole/ul) 2 2

H2O

13.4 13.4
rTaq 0.1 0.1
DNA Template 5 5

 1st, 2nd PCR 모두 30cylces 입니다!

대왕개구리SPEED  |  08.01 11:16  

template가 너무 많이 들어가고 2번 들어가는 방법으로 보이는데 이방법은

nested라기 보다는 2step PCR로 보입니다.

그리고 step별 30cycs을 하는 이유가 있나요?

어떤것을 증폭하는지 모르겠지만 반드시 nested PCR을 해야한다면 디자인을

최적화해야 할것 같고 아니면 일반 PCR로 실험하기 힘드나요?

 

 

알멘붕노예  |  08.01 11:22  

제가 확인하고자 하는 DNA절편이 너무 작고, 미량이라서

1차와 2차의 primer를 다르게 하여 PCR 진행하고 있습니다..

 

DNA template 양은 5ul을 넣지만, 이것도 실제로 1/2000로 희석한 것을 5ul따서 사용합니다.

 

기존에 있던 protocol대로 진행한 것이라 PCR cycle이나 온도는 정해진 대로 진행했습니다.

upload_image

위의 사진은 처음(6월 20일), 같은 양성샘플로 농도만 다르게 했을 때입니다.

 

지금 실험을 진행하다 보니, 일률적으로 결과가 나오지 않는 현상이 보입니다.

한달 정도 시간이 지났기 때문에 DNA가 손상이 된 걸까요?

(* DNA 보관은 실험할 때를 제외하고는 -20°C에 보관합니다.)

대왕개구리SPEED  |  08.01 11:28  

- DNA절편이 너무 작고, 미량이라서 1차와 2차의 primer를 다르게 하여 PCR

진행하고 있습니다..

: 아무리 미량이라도  PCR은 1 step으로 충분히 증폭가능하고 nested PCR을

해야 할 이유는 아닌것 같습니다.

처음 답변에 PCR 정보에 대하여 얘기 했는데 mixture에 대한 정보가 PCR

정보는 아닙니다.

주어진 정보만으로 추측하건데 2step PCR 할 필요는 없고 1step으로 35cycs

증폭하면 충분할 것 같습니다.

또한 N에서 증폭이 일어나지 않게 하는 것이 중요하고 증폭이 되면 모든

시료의 결과는 사용하지 못합니다.

 

 

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