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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 DNA 추출방법 Qiagen 에 대해 질문있습니다ㅠㅠ
올챙이힘내요(대학생)  | 07.31 16:33

DNA 추출을 하고 있는데 잘 안나와서 Qiagen DNeasy blood & tissue kit 가 고가인 값을 한다길래 해봤는데 생각보다 잘 안나와서요

샘플양은 60mg으로 했는데 DNA양이 100도 안나오네요....ㅠㅠ 프로토콜 적혀있는대로 했는데.. 왜 그런지 아시는분 계신가요? 다른점이라면 pk를 제가 기존에 쓰던걸로 한점밖에 없습니다..ㅠ 

그리고 프로토콜에 보면 DNA 양을 늘리려면 AE 넣는 방법을 한번더 반복하라고 써있는데 새로운 AE를 200마이크로리터를 더 넣는건가요 아니면 결과적으로 추출된 DNA 샘플 200마이크로리터를 다시 스핀컬럼에 넣는건가요?

 

아시는 분께서는 꼭 댓글 달아주세요 감사합니다

#DNA
 
#DNA 추출
 
#Qiagen
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리BlackSmile  |  07.31 16:42  

1. 60mg의 tissue를 한 column에서 진행하신건가요? (Large piece의 경우 Small piece로 나눈 다음에 여러 개의 column에서 진행해야 합니다.)

2. Proteinase K의 양은 어느정도 넣으셨나요? Kit에 있던 PK의 농도가 정확하게 기억이 나지는 않지만, 기존에 쓰던 걸로 사용할 경우 들어가는 PK의 양을 새로 계산하셔서 넣으셔야 합니다.

3. PK를 넣고 56도에서 incubation할 때, buffer상에서 완전히 용해되어있어야 합니다.

4.  DNA양을 늘릴려면 AE를 한번 더 넣으라는 것은, Column에 남아있는 여분의 DNA를 추가적인 buffer elution을 통해 gain하라는 뜻입니다. 새로운 AE를 넣으시면 됩니다.

올챙이힘내요  |  07.31 17:13  

친절한 답변 감사합니다! 

1.60mg의 tissue를 녹기 쉽게 작게 잘라서 56도에서 녹였습니다

2.PK는 20µl 넣었습니다 키트찾아보니 농도는 나와있지않았어요ㅠㅠ 완전히 녹아있는 상태에서 진행하였습니다

전기영동을 내려보았는데 평소에 메인 DNA가 잘나오던 샘플도 나오지 않더라구요..ㅠㅠㅠㅠ

개구리BlackSmile  |  07.31 17:19  

혹시 Proteinase K를 kit에 있는 제품이 아닌 기존에 사용하던 제품으로 사용하신 특별한 이유가 있을까요?

회사에서 연구자들이 실험하기 쉽게 kit를 개발한 것이다보니, 시약들도 protocol에 맞도록 농도를 조정해서 상업적으로 판매를 하는 겁니다.

Kit를 구매하신 경우에, 가급적이면 Kit안에 있는 제품들을 사용하는 것을 추천드립니다.

Qiagen의 kit에 들어있는 Proteinase K의 양은 20mg/ml (최소 318 mAU/ml in 30도) 입니다. PK의 양은 어느정도 사용했는지 확인해주세요

올챙이힘내요  |  07.31 17:29  

사실 kit에 PK가 있는지 모르고 평소쓰던 PK를 써버렸습니다ㅠㅠ

평소쓰던 PK를 확인해보니 20mg/ml 였습니다 혹시 spin column의 문제일수도 있을까요? 

감사합니다!

개구리BlackSmile  |  07.31 17:38  

기본적인 거를 여쭤보는걸 깜빡했네요.

"샘플양은 60mg으로 했는데 DNA양이 100도 안나오네요....ㅠㅠ"

--> 100의 단위가 어떻게 되나요?

대왕개구리SPEED  |  07.31 17:41  

kit에 포함된 시약과 동일한 시약을 사용하는 것은 아무런 문제가 없습니다.

proteinase나 rnase가 포함된 kit에서 시약이 모자라는 경우 동일 시약을

사용해도 문제가 없고 DNA양이 엄청게 작게 나오면 문제지만 양보다

quality에 문제없으면 괜찮은거 아닌가 합니다.

DNA quality(흡광도, 전기영동)는 어떤가요?

올챙이힘내요  |  08.03 10:45  
너무 늦게 답변드려죄송합니다ㅠㅠ
단위는 ng/ul 이며
전가영동을 내렸을때 메인 DNA가 전혀나오지않고 흐리게 끌리기만 했습니다
개구리BlackSmile  |  08.03 12:26  

DNA 농도 측정하실 때 A260/A280, A260/A230값도 혹시 같이 측정하셨었나요?

올챙이힘내요  |  08.03 12:56  
나노드랍으로 측정해서 A260/280 만 적어놨습니다!
오늘 다른 상자에있던 걸로 다시 뽑아봤는데 결과는 같았습니다 양은 80ng/ul 정도나왔고 순도는 1.7정도 나왔습니다
개구리BlackSmile  |  08.03 17:07  

1. 혹시 그 Tissue에서 예전에 DNA를 뽑았을 때(Qiagen kit를 사용하기 전)에는 DNA량이 어느정도 나왔었나요?? (예전 방법과 이번 방법에서 amount 차이가 얼마나 날까요?)

2. 이번에 isolation한 양(80ng/ul로 200ul)이 실험을 하는데 부족한 양인가요?

BU  |  08.04 22:15   

처음에 답글을 달아주신 분이 정확한 지적을 했는데, 깨닫지 못하시는 것 같네요. qiagen kit manual 에 쓰여져 있는 수치에 다 이유가 있어요.

60 mg은 스핀 컬럼 하나가 소화해 낼 수 없는 양이에요.

공항에서 짐부치는 데 21 킬로 이상부터 벌금이라고 하면서 저울에 짐을 올려놓았는데, 저울이 잴 수 있는 최대치를 초과하여 부저 소리가 나는게 들리네요.

 

디엔에이 가지고 피씨알을 할 때 초심자 (첨에 선생이 가르쳐준데로 하니까 되더라. 그래서 이제부터 내 맘대로 하기 시작)가 저지르는 실수 중 대표적. 저도 비슷한 실수를 했었기에 적습니다.

 

국그릇 안에 고기 한 두 점 있는 것이 가장 이상적이에요. 밥을 하나도 말지 않더라도.

국그릇 안에 밥이랑 고기가 넘쳐서 국물은 하나도 없고 밥알이랑 고기가 국물을 다 먹은 상태, 밥공기 안에 액체라고는 찾아볼 수없는 그런 상태...

 

그런 상태로 "국밥을 판다"고 생각해보세요. ** 욕나오지.

내가 국물 먹으러 왔지, 밥알이 국 다 흡수한 밥 떡 먹으러 왔나? 고 하지.

 

님의 60 mg이 스핀 컬럼이라는 그릇 안에 리에이전트라는 국물과 함께 국밥을 한 상 차려 놓은 형국이 그러합니다.

 

reagent:  needs to be enough

DNA specimen: smaller is better!. 

e.g. Forensic   CSI Miami : 극소량으로도 범인잡음

 

올챙이힘내요  |  08.05 09:29  

네 BlackSmile님 다른 키트를 쓰거나 PCI를 이용해서 추출해보면 400~500ng/ul 정도 나오며,

부족하진 않지만 Qiagen이 고가인만큼 잘나온다고했는데 다른 방법보다 dna양이 덜 나오는것때문에 혹시 제가 잘못하고있는건지해서요ㅠ

 

BU님 댓글 잘 읽었습니다 물론 저도 처음에는 25mg 정도 재서 했구요 너무 안나오다보니 샘플 양을 늘리면 잘나올까 해서 늘려본거랍니다^^ 프로토콜 써있는 그대로도 해봤고 시약 양을 늘려서도 해봤지만 안나오더라구요

개구리BlackSmile  |  08.05 11:42  

원래 사용하던 양의 거의 1/3에서 1/5밖에 DNA가 뽑히지 않으면 어느 step에서든지 사소한 문제가 생겼을 것 같긴 한데, 글로서 찾기에는 쉽지 않긴 하네요...

 

사실 Kit가 속칭 "비싼 값을 한다"라는 말을 자주 사용하긴 하지만, 저는 연구자 각자에게 맞는 kit가 따로 있다고 믿는 사람입니다(당장 제가 일하는 연구실만 해도 저와 다른 연구원 A는 서로 다른 RNA isolation method를 사용합니다).

원래 사용하던 kit를 사용했을 때에 잘 나왔었는데, 새로 구매한 kit에서 잘 안나오는 경우는 생각보다 꽤 자주 있는 일입니다.

그럴 때에는 '새로 구매한 kit에서 잘 안뽑히는 이유를 찾는 것'과 '원래 사용하던 kit로 돌아와서 빠르게 실험을 진행하는 것' 중에 지금 연구자에게 더 우선시해야되는 순위를 정하시는게 좋을 것 같다는 생각이 들기도 합니다.

지금 DNA isolation이 잘 안된다는 질문으로 약 1주일동안 간략한 discussion이 여기서 오고갔는데, 사실 DNA isolation은 간단한 실험입니다. 1주일이나 discussion을 할 정도로 복잡한 실험이 아니라고 생각합니다.

일단 원래 사용하시던 kit를 이용하셔서 next step을 진행하시는 걸 추천합니다.

올챙이콩순이  |  08.05 13:28  

컬럼 막힙니다. 너무 많이 로딩하면

이경우는 RLT 양도 매뉴얼의 10배, 컬럼도 10개는 써야 할듯합니다. 

정말 그 양이 다 필요하다면... 

 

보통 한 컬럼당 10(6)~10(7) 세포 걸면 50-100ng/ul 나옵니다. 

농도를 높이고 싶으시면 마지막 elute에서 볼륨을 줄이세요.

50ul 일루션 볼륨이 최소입니다. 35ul 해봤는데, 그닥 일드가 좋지 않더라구요

 

일루션 버퍼 좀 덜어서, 55도 heat블럭에다 데워놨다가 일루션하면, 농도 더 높아집니다. 

 

컬럼 capacity만큼만 회수한걸로 보입니다. 

책으로 된 매뉴얼을 인터넷으로 다운받아 자세히 읽어보세요

 

화이링~ 

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