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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 웨스턴 블랏 질문입니다.
개구리n_jyoung92@naver.com(대학원생)  | 07.30 20:31

안녕하세요, 선배님들. 웨스턴 블랏 질문이 있습니다.

1.  2차 항체를 구매하려고 합니다...human mmp-1 antibody (https://www.rndsystems.com/products/human-mmp-1-antibody-36665_mab901#product-details)에 anti-mouse (https://www.rndsystems.com/products/mouse-igg-hrp-conjugated-antibody_haf007)가 워킹하는 게 맞죠? 확인차 여쭙고 싶습니다..

2. 시그널이 약해서 1st AB를 냉장고에서 쉐이킹하며 48시간 붙여보았습니다. 막 만든 5% skim milk에 항체를 희석을 하였는데, 이틀 뒤 보니깐 색과 냄새가 변해있었습니다. 하지만 5% skim milk는 변하지 않았는데요. 항체가 문제가 있는게 아니고 항체를 희석하는 과정이나 명함통 등에서 오염이 있다고 생각해야 하나요?

3. 48시간을 붙여보았지만 시그널이 O/N한 것과 비슷했다면, 항원 문제이거나 본래 발광할 수 있는 한계(?)가 있는 건가요? 

4. human dermal fibroblasts에서 미디어를 통해 ELISA로 secreation을 본 적이 있기에, 미디어로 웨스턴을 내려보았습니다. 그런데 밴드가 하나도 나오지 않았습니다...미디어와 5 times laemmli sample buffer만 혼합하여 사용했습니다. 혹시 미디어로 웨스턴을 할 경우, 다른 방법으로 샘플을 준비해야 하나요?

5. actin의 경우 배경은 거의 하얀색이고 밴드가 매우 선명한 반면, 타겟 단백질은 명암을 조금 어둡게 해야(배경도 함께 어두워짐) 밴드가 보이기 때문에 actin과 타겟 단백질의 배경의 색차이가 불가피하게 생깁니다. 웨스턴을 데이터로 이용할 때 각 단백질의 배경색이 하얗게 통일되어야 하나요? 

#웨스턴
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리Q.E.D.  |  07.31 10:12  
제가 Bio-Rad chemidoc/
las 3000/4000 mini/ 이름모를 듣보잡 기기/
필름도 써봤기에
우선 항체를 구매하기 전에
웨스턴을 어떻게 했는지 조건과
주로 사용하는 시약이 완제품이면
Cat.no 등을 올려주세요

오후 5시 넘어서 수정 할 부분등을 알려줄께요
개구리n_jyoung92@naver.com  |  07.31 13:39  

답변 감사합니다. 선배님 실례지만..메일로 답변 받아 볼 수 있을까요..? 아니면 제 이메일 n_jyoung92@naver.com 로 메일 한번 부탁드려도 괜찮을까요...

개구리Q.E.D.  |  07.31 16:18  
매번 사이트를 확인하기는 귀찮겠지만
혹시라도 제가 놓치는 부분들은 또 다른 분들이
채워 주시기에 여기에 작성하는게 나아요~
주말이니까 찬찬히 작성해 봐요^^
그게 큰것 같아보이지만
이미 기존 랩들에서 누구나 하고 있어서
생각하지도 못하는 부분에서 답변을 얻기도 해요
제가 다른분과 의견이 다를 수도 있는데
오픈 플랫폼이라서 그건 당연한거에요^^
그리고 싸이트에 남기려는 이유는 또 다른
사람들도 도움을 받을 수 있어서 그래요~
개구리BlackSmile  |  07.31 17:58  

1. 1st antibody는 anti-human mouse antibody이고, 2nd antibody는 anti-mouse Goat antibody네요. 문제없이 사용 가능합니다.

2. 

3. 결국에 antibody가 binding할 protein의 양 자체는 정해져있다보니, overnight하는 동안에 왠만한 protein epitope에 antibody는 다 붙었다고 볼 수 있을 듯 합니다.

 

4. ELISA는 pg/ml 단위까지 잡는 굉장히 sensitive한 실험입니다. ELISA로 secretion된 것을 확인하였다고 해도, 그 양 자체가 얼마인지에 대한 정보를 기준으로 다른 실험에 사용할지 여부를 판단합니다.

일반적으로 우리가 western blot을 할 때 20~30ug total protein을 이용해서 western을 진행하고, Purified protein으로 western을 할 때는 10~100ng protein을 이용합니다. ELISA에서 잡힌 양이 ng 단위라면 충분히 western으로 band를 잡을 수 있겠지만 굉장히 적은 양이 있는 경우에는 western에서 안나오는 경우도 많습니다.

우선, ELISA에서 확인된 protein의 양을 한번 확인해보세요.

 

5. 사실 동일한 background에서 band intensity를 잴 수 있는 조건을 잡는게 가장 좋은 방법이지만, 실험이 도저히 진행되지 않는다면 Background를 어둡게 한 사진을 ImageJ를 이용해서 정량해도 큰 문제는 없을 듯 합니다.

개구리Q.E.D.  |  08.03 15:24  
중간에 분명히 문제가 있어서
그걸 확인해 주려고 했는데
계속 기다릴 필요가 없을 것 같아서
이 질문과 아이디에 답변 그만 할께요^^
윗 분 답변도 참고하구요,
그럼 실험 잘 하세요!
개구리n_jyoung92@naver.com  |  08.04 06:29  

[BlackSmile] 답변 정말 감사드립니다. 답변은 일찍 확인했는데 몸이 갑자기 안 좋아져서..인사 드리지 못했습니다. 참고하여 다시 해보겠습니다.

 

[Q.E.D.] 답변 감사드립니다. 도움주시려고 하는 큰 마음에 감사하고 있는 찰나에...몸이 갑자기 나빠져서 인사 드리지 못했습니다. 혹여라도 실망하셨다면 죄송합니다.

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