실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
웨스턴 블랏 질문입니다.
레벨5 n_jyoung92@naver.com (대학원생)
안녕하세요, 선배님들. 웨스턴 블랏 질문이 있습니다.
1. 2차 항체를 구매하려고 합니다...human mmp-1 antibody (https://www.rndsystems.com/products/human-mmp-1-antibody-36665_mab901#product-details)에 anti-mouse (https://www.rndsystems.com/products/mouse-igg-hrp-conjugated-antibody_haf007)가 워킹하는 게 맞죠? 확인차 여쭙고 싶습니다..
2. 시그널이 약해서 1st AB를 냉장고에서 쉐이킹하며 48시간 붙여보았습니다. 막 만든 5% skim milk에 항체를 희석을 하였는데, 이틀 뒤 보니깐 색과 냄새가 변해있었습니다. 하지만 5% skim milk는 변하지 않았는데요. 항체가 문제가 있는게 아니고 항체를 희석하는 과정이나 명함통 등에서 오염이 있다고 생각해야 하나요?
3. 48시간을 붙여보았지만 시그널이 O/N한 것과 비슷했다면, 항원 문제이거나 본래 발광할 수 있는 한계(?)가 있는 건가요?
4. human dermal fibroblasts에서 미디어를 통해 ELISA로 secreation을 본 적이 있기에, 미디어로 웨스턴을 내려보았습니다. 그런데 밴드가 하나도 나오지 않았습니다...미디어와 5 times laemmli sample buffer만 혼합하여 사용했습니다. 혹시 미디어로 웨스턴을 할 경우, 다른 방법으로 샘플을 준비해야 하나요?
5. actin의 경우 배경은 거의 하얀색이고 밴드가 매우 선명한 반면, 타겟 단백질은 명암을 조금 어둡게 해야(배경도 함께 어두워짐) 밴드가 보이기 때문에 actin과 타겟 단백질의 배경의 색차이가 불가피하게 생깁니다. 웨스턴을 데이터로 이용할 때 각 단백질의 배경색이 하얗게 통일되어야 하나요?
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