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 전체 > Cell Biology > Cell lysis/Apoptosis
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질문 flow cytometry에 대해 아시는 분 답변부탁드립니다.
알dlrhkdgus(대학원생)  | 07.29 16:43

안녕하세요. cell apoptosis를 flow cytometry로 보고 있는데

해결책을 찾지 못해서 질문드립니다.

 

제가 cell을 키워서 H2O2처리한 다음에 flow cytometry (FITC, PI) 로 보고 있는데

여러 조건들 중에서 특정 조건은 event가 5000이렇게 나옵니다.

다른 조건들은 다 10000 나오는데 특정 조건에서만 그렇고

제 가설에 의하면 가장 toxic한 자극을 맞은 조건에서 그렇게 나옵니다.

cell이 너무 많이 죽어서 event가 이렇게 떨어질 수 있나요?

이런 경우에 조건을 어떻게 바꾸면서 볼 수 있는지 문의드립니다.

 

나름 덜 toxic한 조건으로 해보기도 하고 그랬는데도 계속 이렇게

나오니 답답하네요..

 

미리 답변 감사드립니다. 

#flow cytometry
 
#apoptosis
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리bio  |  07.30 05:38  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cell이 튜브에 남아있는데 total event가 5000을 찍나요? 아님 특정 gating에서 5000만 찍나요? 

보통 fsc하고 ssc로 gating 잡고 apoptosis를 확인하던지 PI DAPI로 staining 해서 apoptosis를 확인하던지 하는데요. FITC는 왜 사용하는것인가요?

 

알dlrhkdgus  |  07.30 23:10  
첨부파일 파일첨부: fig.JPG (154 KB)
이미지 첨부파일

 선생님. 답변주셔서 정말 감사합니다.

사실 제가 Flow cytometry에 대해서는 거의 지식이 없어서 저희 기관 조교님에게 거의 일임하다 하고 있습니다.ㅠㅠ

첨부한 사진 보시면 어떤 조건에서는 10000개 다 읽는데 어떤 조건에서는 5000개 밖에 못 읽고 있습니다.

gating을 잘 못 잡은 것일까요?

혹시 그렇게 생각하신다면 어떻게 gating 잡는게 좋을지 조언 부탁드립니다.

그리고 일반적으로 apoptosis를 할때 어떻게 하시는지 같이 알려주시면 감사하겠습니다.

 

답변 정말 감사합니다. 

 

개구리bio  |  08.01 06:04  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

데이터를 보면 total  event가 10000 오른쪽은 5000이 조금 넘네요. 

혹시 오른쪽 샘플의 경우 cell이 flow를 하기에 충분한것은 맞나요? cell 자체가 5000조금 넘는것은 아닌가 생각이 드네요. 혹시 H2O2 처리후 세포가 완전하게 죽어버리나요?

http://www.cyto.purdue.edu/archive/flowcyt/research/cytotech/amfc/data/page3.htm

일반적으로 apoptosis가 일어나면 chromatin condensation이 일어나서 ssc가 바뀝니다. (링크 참조) 그래서 혹시 gating이 문제인가 생각이 들었는데 그런 이유는 아닌거 같습니다. 

그런데 첨부한 데이터를 보면 그렇게 큰 차이를 볼수가 없는데요. H2O2를 처리했을때 apoptosis가 실제로 일어나는지 확실하지가 않네요..

plate에 붙어 자라는 세포라면 acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) 처리해서 apoptosis를 형광 현미경으로 간단하게 확인 해 볼수도 있습니다. 이 후 flow를 돌려서 좀더 quantitative한 결과를 얻는 것은 어떨까 생각이 듭니다. 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4332266/

배양액  |  08.03 09:14   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

배양 후 배양액은 어떻게 하셨는지요?

무언가 처리 후 cell apoptosis시 거의 죽은 세포들은 배양액에 떠 있을것으로 생가해서 저는 배양액까지 모와서 분석합니다.

알dlrhkdgus  |  08.03 11:18  

답변주신 두분다 정말 감사드립니다.

 

제 생각에는 H2O2쳤을 때 cell이 너무 심하게 죽어서

저런 결과가 나왔을 것이라고 생각했습니다.

 

처음 키우는 cell 양은 비슷하다고 생각되어서요.

 

말씀하신 방법대로 배양액을 모아서 해보거나, 다른 약물로 

처리하고 apoptosis보는걸 시도해보겠습니다.

 

정말 감사합니다. 

 

 

개구리무광  |  08.03 14:27  

adherent cell로 하시는 것 같은데
collection하기전에 현미경으로 보면 죽어서 떠있는 세포들이 많았나요? 

그럴 경우
만약 해당 약물이 cell death (apoptosis)를 유발한다는 정도를 보려면

윗 분들 말씀대로 배양액까지 같이 모아서 FACS 하시거나

drug 조건을 조금 낮춰서 (시간을 줄이거나 농도를 낮춤) 해보시는 건 어떨까요

둘 다 적용해도 되구요

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