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질문 96 well plate에서 배양 시 배지가 마르는 문제.. (대장균 배양)
알와글와글(대학생)  | 07.29 15:02
첨부파일 파일첨부: 22222.jpg (1.40 MB)
이미지 첨부파일

안녕하세요, 실험하는 중에 막히는 것이 있어 이렇게 질문을 올립니다..

 

제가 하려고 하는 실험을 먼저 간단하게 설명드리자면,

96 well plate에 액체 배지를 200 uL씩 분주한 다음, 

각 well에 대장균 콜로니를 접종하고, 

배양과 동시에 enzyme 발현을 한 다음(단백질 발현에 필요한 물질들은 액체 배지에 미리 포함),

일정시간 후 centrifugation 하여 액체배지는 제거하고 남아있는 대장균 pellet을 이용하여 enzyme 반응을 시켜 screening을 하려고 합니다. 

 

그런데 가장 처음 대장균을 배양하는 단계부터 삐걱거리고 있습니다...ㅠㅠ

 

1. 96 well plate에서 24시간 넘게 배양을 해야 하는데(온도는 28도 정도입니다), 그럴 경우 뚜껑을 닫아도 배지가 거의 말라서 균이 자라지 못합니다.

2. 그래서 위에 빈틈이 아예 없도록 위에 테이핑을 해보았는데요. 배지는 안 마르는데 여전히 균은 안 자랍니다..

 

(2번 문제점같은 경우에는 aeration 이 안 되어서 그러는 게 아닐까 싶은데, 차라 배지 volume을 절반으로 낮추는  게 나을까요?)

 

같은 부피(200 uL) 의 액체배지에 e tube에서 키웠을 때는 균이 잘 자라서 pellet도 어느 정도 보였는데, 96 well plate에서는  안 자라서 정말 고민입니다. ㅜㅜ

가짓수가 상당히 많아서 시간관계상(?) 무조건 96 well plate를 사용해야 하는지라 ..

96 well plate는 처음 사용해봐서 상식이 부족한 탓에 더욱 어려움을 겪고 있습니다 ㅠㅠ..

 

(사용한 제품은 새로 주문한 게 아니라 실험실에 오래 묵혀있던 것인데, 제품번호가 명시되어있지 않아 정보를 찾기가 어렵네요..ㅠㅠ 일단 제품 포장지 사진을 첨부하였습니다.. 박테리아 배양에는 코팅되어있지 않은 제품이 권장된다고 하는데, 혹시 제가 코팅되어있는 제품을 사용하고 있다면 그것이 원인일 수 있을까요?)

 

팁이 있으시다면, 도움 부탁드립니다. 읽어주셔서 감사합니다. ㅠㅠ

#96 well plate
 
#박테리아 배양
 
#대장균
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.29 15:13  

1. microwell plate는 원래 미생물 배양용으로 개발된 제품이 아닙니다.

일단 shaking이 잘 안됩니다.

배양 중 균체가 바로 바닥에 가라앉습니다.

2. 28도에서 하루정도 배양으로 마르지는 않을 건데 이상하네요.

3. 실험은 실험자 입장에서 하는 것이 아니고 실험 결과 입장에서 하는것이라고

봅니다.

예전에 미생물 screening할 때가 있었는데 e-tube로 하루에 300개 정도 배양을

일주일 정도 했습니다.

제가 만약에 한다면 e-tube로 실험할 것 같습니다.

알쏘오쿨  |  07.30 08:22  

일단 위에 분 말씀처럼, 단순히 많은 수를 동시에 해야한다고 해서

96well plate를 사용한다는 것은 맞지 않을 것 같습니다.

일단 접종 볼륨 자체가 너무 적고, 200ul 볼륨에 콜로니 접종이 가능한가요?...

이쑤시개로 접종하는 정도라면 가능하겠지만, 그렇게 해서 자란다한들

이게 분별성있는 실험일지 의문이네요... 

plate 자체 구조가 culture용이 아니라 아무리 세게 shaking 한들 효과는

없을테고, 접종비 자체가 너무 안맞습니다. 배지가 너무 적어요...

좀 수고스럽더라도 확실한 실험 결과를 얻기위해서 최소한 e-tube 이상, 

1ml 이상 볼륨에서 해야하지 않을까 합니다.

알와글와글  |  07.30 11:13  
선배님들 조언 정말 감사드립니다 ㅠㅠ
빨리 해야한다는 생각에 가장 중요한 걸 놓치고 있던 것 같아 반성이 되네요..
답변 다시한번 감사드립니다! 도움이 많이 되었습니다
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