실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
his tag 정제하는데 분리가 잘 안 됩니다..
레벨5 해징 (대학원생)
안녕하세요. 단백질 정제를 처음 해보는 석사과정 학생입니다.
ge healthcare의 histrap hp 5ml packed column을 가지고 his tag 정제를 하고 있습니다. akta prime 기계를 이용하여서 정제를 진행하였습니다.
하지만 정제를 해보았을때 원하는 단백질 외에 다른 단백질이 계속 같이 나오는 것을 확인하였습니다. ( sds gel 사진-fraction 5-11까지의 밴드입니다, 빨간줄이 제가 원하는 단백질입니다. )
이미다졸 농도는 여러번의 테스트 결과 25 mM 에서 단백질이 용출되는 것을 확인하여 최종 농도를 100 mM로 해서 0-100 mM 이미다졸까지 gradient를 걸었습니다.( flowrate 5 ml/min, total volume 200 ml)
분리된 uv 피크를 보면 이 단백질들이 피크가 하나처럼 나와서 elution 조건을 바꾸어도 분리가 안 될거 처럼 보입니다.. (혹시 아니라면 말씀해주세요!ㅠㅠ)
그래도 사이즈 차이가 많이 나니 Size exclusion chromatography를 통해서 분리를 하면 되지 않을까 생각이 들었습니다.
실험실에 sephacryl-300 HR이 있는 것을 확인하여 이것을 사용해볼까 하는데 맞는 방법일까요..?
아니면 elution 조건을 바꾸면 분리가 될까요..?
조언을 구할 사람이 없어 너무나 헤매고 있습니다
고수님들이 도와주시면 큰 도움이 될 것 같습니다.. 감사합니다!!
Bio마켓 프리미엄