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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR primer 짤 때 질문이요!!
올챙이Vind(일반인)  | 07.28 11:26

안녕하세요

pcr로 template를 뜨기위해서 primer를 짜서 PCR을 진행했는데 밴드가 안떴습니다ㅠㅠㅠㅠ

RNA virus에 있는 outer capsid protein인데 NCBI에서 protein 이름으로 나오는 nucleotide 서열을 가지고 primer를 짰습니다.

그런데 밴드가 안떠서 찾다보니 mRNA 서열로 primer를 짜야한다는 말이있어서요...

근데 제가 3가지 type의 RNA정보로 primer를 짰는데 이중 2가지는 mRNA정보가 없습니다...

꼭 mRNA 서열로 primer를 짜야하나요??ㅠㅠ

#PCR
 
#primer
 
#RNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  07.28 11:30  

template로 어떤걸 사용했나요?

올챙이Vind  |  07.28 11:33  

PCR 때 넣어준 template는 분변에서 prep한 viral RNA를 사용했습니다.

대왕개구리SPEED  |  07.28 11:38  

RNA template로 Taq pol.을 사용하여 direct PCR이 가능할까요?

올챙이Vind  |  07.28 11:59  

아아 RT-PCR 진행하였습니다!! cDNA 합성까지 한번에 되는 premix 사용해서 진행하였습니다

대왕개구리SPEED  |  07.28 12:46  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

cDNA를 전기영동해서 확인해 보세요.

intron이 없을것이기 때문에 무리없이 1st strand 합성 후 증폭 가능할 겁니다.

올챙이Vind  |  07.28 12:56  

prep한 viral RNA를 RNA정보로 짠 primer를 이용iral RNA를 RNA정보로 짠 primer를 이용해서 cDNA 합성까지만 한 후에 확인해보라는 말씀이시죠?? 그상태에서 밴드가 뜨면 primer가 제대로 짜여진거라는 말일까요?

대왕개구리SPEED  |  07.28 13:16  

1st cDNA, 2nd dsDNA를 만들 때 사용한 실험 방법이 어떤건가요?

올챙이Vind  |  07.28 14:06  

단순 확인용으로 시행하고있는거라서 원스텝으로 cDNA합성까지 되는 RT-PCR premix 써서

50도 30분

95도 15분

94도 30초

55도 30초

72도 30초 *34cycle

72도 10분 으로 돌렸습니다. 

 

primer Tm값이 57~58 대라서 55도로 돌렸구요.

대왕개구리SPEED  |  07.28 14:09  

specific primer를 사용해서 1st를 합성 했다면 1st strand를  전기영동해서  band가

나오는지 확인해 보세요.

올챙이Vind  |  07.28 14:53  

넵 감사합니다!!

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