실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
Vector (Plasmid) clonning 문의드립니다.
레벨1 헿헿 (대학원생)
안녕하세요. 대학원 1학기를 마무리 짓고 2학기를 기다리고 있는 학생입니다. 생긴지 얼마 되지 않는 lab이라 선배는 있지만 따로 사수가 없어서 궁금해서 여기에 올려봅니다.
실험의 전체적인 목적은 다음과 같습니다.
갖고 있는 vector (pAAV-hSyn1-EGFP-P2A-EGFPf-WPRE-HGHpA)에 특정 mRNA만 발현하는 fragment를 ligation 시킨 후에 세포의 RNA sequencing을 할 예정입니다. 이에 대해 제가 ligation할 fragment를 design하고 있습니다. vector에 대한 대략적인 모십도는 아래에 나와있습니다.
그림에서 3360번째 자리 (AAV2 ITR과 hGH poly(A) signal 사이)에 fragment를 ligation 시켜서 mouse neuron cell에 transfection시켜서 fragment에 있는 RNA가 발현이 되는지를 확인을 하려고 합니다. 여기서 제가 문의드릴게 있어서 부탁드립니다.
1. RNA-seq을 할 때, Poly-A tail이 있어야 mRNA에 대한 sequencing을 할 수 있는데 그럼 fragment에 Poly A tail에 대한 sequence가 있어야 하나요? 예를 들어서 fragment: 5' ~~~~TTTT....T-3' 이렇게 서열이 포함되어야 하나요? 진핵세포에서 보통 mRNA processing중에 150 ~ 200 mer 정도의 A tail이 붙는다고 하는데 이 정도를 포함시켜서 fragment를 설계해야하는지 궁금합니다.
2. 저는 fragment에 strong promoter(예를 들어 SV40, CMV promoter)를 포함시켜서 fragment에 있는 특정 서열을 mRNA로 발현시키려고 합니다. 그렇다면 저 위치에 그냥 promoter만 있으면 실제로 발현이 되나요? 또한 특정 서열을 전사시키고자 하면 보통 promoter sequence와 특정 서열 간에 거리를 얼마나 두고 설계를 하나요? 이것이 확실히 발현되려면 어떠한 구조로 sequence를 설계해야 하나요?
3. 마지막으로 보통 DNA transcription이 될 때, promoter의 위치가 transcription이 일어나는 site보다 upstream에 위치하는데 저 위치가 아니라 보통 어떻게 설계하시는지 궁금합니다. 또한 mRNA만 발현해야되는 경우 RBS, 종결코돈도 포함하여 설계해야 하는지 궁금합니다.
감사합니다.
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