실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Gene Cloning
subcloning 마지막 확인 단계인 plasmid cutting시 band 양상이 이해되지 않아 질문드립니다.
레벨1 geunii (대학원생)
안녕하세요, sub-cloning을 진행하는 과정에서 이해가 잘 안되는 결과가 있어서 질문드립니다.
제가 약 1kbp의 insert gene을 약 6kbp의 발현 vector에 sub-cloning을 진행중인데
ligation 전까지 전기영동으로 확인했을 때에는 얻은 band의 size가 위에 말씀드린 크기와 같음을 확인했고,
그 후 gel로부터 DNA를 purification 하여 ligation을 한 뒤 transformation을 하고 colony를 얻었습니다.
(sub-cloning 과정을 수행할 때에 문제점은 없었던 것으로 판단되어 위 내용을 설명드렸습니다.)
얻어진 8개의 colony를 키워 각각 minipreperation을 통해 plasmid를 정제하였는데
정제된 plasmid를 바로 전기영동 했을 때(위의 사진)와 그 plasmid를 제가 sub-cloning에 사용했던 제한효소인 EcoR1 및 Xho1으로 double digestion한 결과(아래 사진)을 비교하면
저의 생각으로는 오히려 아래 사진이 plasmid를 아무 처리하지 않고 전기영동 했을 때 open circular plasmid, linear plasmid, supercoiled plasmid로 나뉜 3개의 band로 나타난 양상과 유사하다고 보여지는데(물론 size는 맞지 않아보입니다. 이 점도 잘 이해가 되지 않습니다.)
만약 위의 사진에서 supercoiled plasmid로 하나의 band만 나타난 것이라고 가정했을 때
왜 enzyme으로 cutting했을 때 아래 사진과 같은 양상으로 band가 나타나는지 궁금합니다.
저의 예상으로는 supercoiled plsmid(위의 사진)가 원래 size보다 작은 위치에서 band가 관찰될 수 있고, cutting 후에는 linear DNA 이기 때문에 원래 size로 나온 것이며 결국 cloning이 실패한 것이라고 생각되는데
혹시 제 예상이 맞는 것인지 한 번 봐주시면 감사하겠습니다.
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