BL21을 사용했나요? 아니면 BL21(DE3) 계열을 사용했나요?
pET28은 T7 promoter + LacO 구조로 발현 합니다.
따라서 BL21은 발현시키지 못합니다.
공발현 substrate vector는 어떤 vector를 사용하나요?
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레벨1
꿈냥이
(대학원생)
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20.07.21 22:33
BL21(DE3)로 진행했습니다!
substrate vector로는 pAC계열을 사용합니다. 제가 발현시키고자 하는 것이 carotenoid 생합성 gene이어서요..!
질문을 정확히 해야 문제점 해결에 도움이 됩니다.
전배양 부터 발현까지 상세한 설명이 필요합니다.
모든 클로닝 유전자는 pET vector에서 염기서열 분석을 했나요?
그리고 기질은 발현되나요?
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레벨1
꿈냥이
(대학원생)
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20.07.22 10:00
SPEED님 답변 주셔서 감사합니다! 제가 어제 핸드폰으로 작성하여 빠뜨린 부분이 많네요..
[전배양]
seed culture : 최대 2주내에 T/F한 single colony를 항생제( KM + CAM)가 들어간 LB 3ml에 37도로 O/N시킵니다.
Main culture : 이후 이의 OD600값을 측정하여 0.1로 희석 (KM + CAM이 들어간 LB)하여 total volum이 5ml이 되도록 맞춥니다. 37도 220RPM의 shaking incubator에 넣어 cell을 키운 뒤 그 당시 condition에 해당하는 OD600값까지 키우고, 그에 해당하는 IPTG를 넣어 줍니다.
[염기서열 분석]
네! pET vector에서 sequencing을 진행하여 서열이 바르게 들어갔음을 확인하였습니다. 사용한 제한효소 자리는 BamH1(앞), Sal1(뒤)입니다.
[기질발현]
네 기질 vector에서 단백질이 발현이 되는지의 여부는 carotenoid이다 보니 HPLC를 통해 확인하였습니다.
뿐만 아니라 제가 넣은 Expression gene이 발현되어야 다음 단계 물질들이 생성되는데 다음단계 물질들이 있는 것도 확인되었습니다!
발현 균주는 TF 한 후 바로 사용하는 것이 가장 좋습니다.
그리고 발현 균주는 보관 하는것이 안좋습니다.
전배양을 길게하지말고 2~3시간만 하고 바로 본배양에 들어가는 것이 발현에
좋습니다.
carotenoid도 vector에서 생산하나요?
E. coli에서 외부유래 단백질을 발현시킬때에는 rare codon 문제가 있으므로 codon optimization 또는 rare codon 문제가 해결된 Rosetta(DE3) strain을 테스트 해보시는 것을 추천드립니다. 그리고 단백질이 발현된다 하더라도 SDS-PAGE상에서 제대로 보이지 않을 수 있기 때문에 만약 target 단백질이 tag이 달려있다면 western blot을 통해 확인해보는게 발현 여부를 판단하기 편합니다.
만약 cell growth rate가 낮다면 target 단백질이 cell에 toxic한 경우도 있으므로 이럴때는 pLysS가 포함된 strain을 사용하거나 glucose 등을 첨가하는 것도 하나의 방법입니다.
첨부된 젤 사진을 보면,
BL21(negative control)에 비해서 A와 B는 induction(된 것으로 보이는) band가 하나 보입니다.
크기가 맞다면 아마도 induction된 단백질이 맞을 감능성이 있습니다.
두번째 젤사진을 보면,
induction 여부에 무관하게 원하는 크기의 밴드가 보입니다.
그것은 아마도 IPTG가 없어도 유전자가 발현되는 현상(leakage라고 부릅니다)이 아닌가 싶군요.
T7/lacO 시스템을 사용하다 보면 종종 이런 현상을 봅니다.
IPTG를 넣지도 않았는데 클로닝된 유전자 발현이 되는 경우죠.
그래서 이런 결과가 나오면,
1. BL21(DE3)/pET28a
2. BL21(DE3)/pET28a - IPTG
3. BL21(DE3)/pET28a-gene
4. BL21(DE3)/pET28a-gene - IPTG 를 젤에 걸어보세요.
아마도 1과2에는 없는 밴드가 3과 4에서 보일겁니다.
일반적인 예상대로라면 4에서만 원하는 밴드가 나와야 하는데 말이지요.
그러면 leakage 입니다.
leakage가 맞다면 IPTG 없이 재조합 단밷질을 정제하면 됩니다.
확인이 필요하다면 2와 3을 소량, 대략 3-5ml 을 sonication시키고 젤에 걸어서 soluble fractiobn에 발현된(것으로 보이는) 단백질이 soluble한지 확인하세요.
Soluble 하다면 soluble fraction에 Ni-affinity resin을 10ul 정도 넣어서 pilot scale로 정제 해 보세요.
2에서는 Ni-resin에 아무것도 안붙고 3 또는 4에서 정제되는 단백질이 발현된(것으로 보이는) 단백질 크기라면 leakage가 맞습니다.
Leakage 는 pLysS 벡터가 들어있는 BL21(DE3) 균주를 사용하면 방지할 수 있습니다)
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레벨1
꿈냥이
(대학원생)
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20.07.23 10:34
어제 일정이 있어 컴퓨터를 사용하지 못해 답변들을 읽기만 하고 물어보신 것들에 답을 드리지 못했네요.. 다들 정말 감사합니다! ㅠㅠ
[SPEED 님]
전배양을 길게 하지 말라 하셨는데 seed culture를 말씀하시는 건지 IPTG를 넣기 전까지의 Main culture를 말씀하시는 건지 헷갈립니다 ㅠㅠ
Seed culture는 O/N을 하고 Main culture IPTG 넣기 전까지는 2~3시간 내에 원하는 OD값에 도달하여 IPTG를 넣습니다.
carotenoid도 vector에서 생산합니다! 전구물질은 substrate vector를 통해 만들어 냅니다.
[Nmhyk님]
어제 Western을 통해 (his taq antibody이용) 원하는 target size의 밴드를 진하게 확인할 수 있었습니다! ㅠ protein은 확실히 발현되는 것 같습니다.
당장 pLysS가 포함된 strain을 구할 수 없기에 우선 glucose를 첨가하여 진행해 보겠습니다! 감사합니다.
방금 확인해보니 제가 사용하는 substrate vector와 항생제 저항성이 같은 vector라 selection이 어려울 것 같은데 이는 어떻게 해결할 수 있을까요..? ㅠ
[강시님]
저번에 cloning에서 주신 조언들 덕분에 성공할 수 있었습니다! 감사합니다.
젤에 걸어보라고 하신 condition들을 gel에 걸어보았을때 말씀하신 것처럼 3과 4에서만 밴드를 확인할 수 있었습니다.
leakage가 맞는 것 같은데 교수님께서 over-expression이 되지 않으면 발현이 안된거라고 하셔서.. 실제로 western에서도 target size의 밴드를 확인할 수 있었습니다..
soluble한지 우선 확인해보고 말씀하신 pilot scale 정제를 한번 해보도록 하겠습니다. pLysS가 들어간 BL21(DE3)을 검색해보니 제가 사용하는 substrate vector와 항생제 저항성이 같은 vector라 selection이 어려울 것 같은데 이는 어떻게 해결할 수 있을까요..? ㅠ
leakage가 발생하는 경우 IPTG를 넣으면 발현이 증폭되지 않고 IPTG를 넣은것과 넣지 않은 것에 차이가 없는 것인가요..??
모두들 답변 주셔서 정말 감사합니다!