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cytotoxicity assay실험 ㅠㅠ
레벨1 화이팅해야지 (과기인)
안녕하세요.
cell cytotoxicity assay를 setting하고 있는데요.
여러 문제가 있어서 문의하려고 합니다.
CFSE, Calcein AM, LDH assay모두 사용했지만
Calcein AM으로 질문드리려고 합니다.
OT-1의 CTL과 Cancer에 OVA를 처리해서 cytotoxicity를 확인하는 실험을 하고 있습니다.
먼저 target cell (cancer)에 OVA 10 uM로 1 ~ 2 hr 처리 후 washing
이후에 cell에 calcein AM을 staining하고 washing했습니다.
OT-1 CTL의 경우 OT-1 spleen에서 MACS CD8 T cell isolation하고
CD3,CD28 activation, daily IL-2 처리했습니다.
그리고 나서 정해진 Target cell을 96 well plate (u-bottom)에 adding하고 CTL을 1:1 ~ 80:1 (E:T)처리했습니다.
추가로 spontaneous release와 maximum release (1% Triton X-100이 되도록)도 확인했습니다.
여기서 결과는 대체로 spontaneous보다는 높은데 E:T ratio dependent cell lysis를 관찰을 못하고 있고 오히려 T cell이 많아짐에 따라서 RFU값이 감소하는 결과를 지속적으로 확인하고 있습니다.
해당 문제에 대해 해결방안 (Troubleshooting)이 무엇이 있을지
T cell이 많아지는 것에 따라서 RFU가 감소하는 이유가 무엇일지 도움을 주시면 감사하겠습니다.
답변 부탁드리겠습니다.
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