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어떤 방법으로 제작했고 40ng 수율은 어떤 방법으로
측정했나요?
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레벨1
김홍기
(대학생)
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20.07.16 08:55
1.우선 사용중인 pgem t easy vector 를 사용하여 블루콜로니를 만들었습니다.
2.제한효소를 이용해 blunt 를 만들었습니다.
3. ciap를 이용해 self ligation을 방지하였습니다
4. 전기영동하여 선형 플라시미드를 확인하고 gel puri 하였습니다.
5. DTTP와 GO Taq을 사용하여 70도에서 반응시켯습니다.
6. pcr puri 진행하였습니다.
농도는 나노드롭을 이용하여 측정하였습니다.
마지막에 흡광도 측정하는 것은 T vector 만드는 수율하고는 관계 없고
vector DNA자체가 사라진것 같습니다.
PCR product는 primer를 kination시키기 않으면 5' 말단에 Pi가 없습니다.
이것을 벡터에 클로닝시키기 위해서 PCR product에 PNK 처리해서 Pi를 붙여주던가 아니면 벡터의 말단에 Pi가 붙어 있어야합니다.
이는 t-벡터도 마찬가지입니다.
t-벡터의 말단에 3'-T가 붙어 있지만 이는 인서트와 annealing하기 위한 것인뿐, ligase가 작용할 수는 없습니다.
CIP 처리단계를 빼야할것 같습니다.
T vector를 만들어서 사용 가능한 방법은
1. Taq pol.을 사용하여 +T
2. klenow exo-를 사용하여 +T
3. 제한효소로 잘라 3' T가 나오는 vector를 제작하여 사용
이 사이트 안에도 검색을 해 보면 관련주제로 엄청나게 많은 질답이 있습니다. 제가 방금 찾기를 해보니까 무려 10년 전에 위의 두분이 비슷한 답을 단 질문도 있었습니다. 검색(!) 꼭 해보세요.
linear vector를 만드는데 무려 두번씩이나 정제를 해서는 높은 수율을 기대하기가 어렵습니다. 가장 좋은 방법은 XcmI으로 잘라서 한번에 만드는 겁니다. T-vector 플라스미드는 역사가 오래된 주변 실험실의 냉동고에 꼭 있습니다. 이름이 제각기 일 수 있지만 보통은 XcmI이라는 말꼬리가 달려 있으니까 리스트에서 잘 뒤져 보세요. 저도 여기 브릭의 초창기에 황인환 교수님이 배포하신 pBlu-XcmI을 잘 사용했고, 또 Gateway 버전으로 몇가지 만든 것도 있습니다. 만들 땐 힘들었지만, 저도 받아서 써 왔기 때문에 주변사람들에게 잘 나눠주고 있습니다. 이거 직접 만든다고 실험이 잘 되는 게 절대 아니니까, 우선은 주위에서 잘 찾아 보세요. 그게 안되면 실험실 지도교수님을 통해서 수배하면 됩니다. 최후의 방법으로 Addgene 같은 곳에서 65불 내고 분양받는 수도 있어요. 그래도 인건비에 비하면 싼 거죠.