실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
western blot 단백질띠가 안보여요 ㅠㅠ
레벨1 지이니 (대학원생)
안녕하세요 웨스턴 블랏 실험중인 대학원생입니다
지금까지 3번정도 웨스턴을 진행하고 있는데 베타엑틴은 비교적 잘 나오는데 cleaved caspase-3,-9이 나오지 않아서요,, 단백질은 휴먼세포에서 정량했고 로딩은 40ug으로 진행하였습니다
1차 안티바디는 처음에 1000:1로 하였는데 백그라운드가 너무 진해서 이번에 2000:1로 처리하였습니다. 더 많이 희석하나 적게하나 띠가 안보이는거는 똑같습니다..
2차안티바디는 5000:1로 하였구요 host랑 다 맞게 확인해서 진행하였습니다.
블로킹은 5% BSA(TBS)로 1시간 하고 워싱은 TBST로 5분마다 3번 진행하고 1차안티바디는 2000:1로 희석해서 4도씨에 O/N시켯습니다. 그후 같은 조건으로 워싱하고 2차안티바디 5000:1로 1시간 R/T 후 워싱 후 측정하였습니다..
원래 cleaved caspase라인이 웨스턴 하기 힘든가요 ? ㅠㅠ
무엇이 문제일까요 ,, 도와주세요
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